1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）
盐酸阿霉素又名14-羟基柔红霉素，是一种广谱抗肿瘤药物，属于蒽环类抗生素家族，临床可用于急性白血病、甲状腺癌、乳腺癌、肝癌等多种癌症患者的治疗，其作用机制主要是阿霉素分子嵌入DNA从而抑制核酸的合成，最终杀灭癌细胞[1]。但盐酸阿霉素在临床使用中受到严重的副作用所限制，例如严重的心脏毒性和骨髓抑制，还会导致，口腔炎、恶心、呕吐和脱发，对此Arcamone等人调查研究了癌症患者对化疗所引起的这些副作用的看法，显示这些都一定程度的对患者的生活质量造成了影响[2]。因此，为克服其治疗的众多风险意味着需要新的治疗方案。通过查阅资料及实验研究发现，糖基化对其生物活性的发挥具有重要影响，糖部分(daunosamine)是蒽环类抗生素的基本成分，具有抗肿瘤功效和TOP中毒活性[3]。即使对蒽环类抗生素的结构进行微小的修改，也会对蒽环类抗生素的亚细胞分布、细胞毒性活性和作用方式产生显著的影响，这表明对其通过结构修饰合成新的化合物仍然是一个研究课题。近年来，人们在研究盐酸阿霉素结构修饰方面取得了很多成就。比如，Denel-Bobrowska M 等发现含有游离NH2基团的糖部分是蒽环类抗生素抗肿瘤功效和拓扑异构酶毒性的重要组成部分，在其C3位置的适当取代基诱可导有益的细胞毒性和抗肿瘤活性[6]。前期研究中我们发现前期我们发现地衣芽孢杆菌来源的糖基转移酶UGTBL1能够催化盐酸阿霉素并生成相应的糖苷，本次研究即优化其糖基化催化反应条件，并进一步对糖苷产物进行分离纯化与结构鉴定[4]。
糖苷是糖半缩醛羟基与配体分子缩水缩合形成的含糖衍生物，对于人类有着重要的生理和药理作用，糖基是这些化合物不可或缺的重要组成部分。合成糖苷类化合物时，可通过化学法合成糖苷、生物法合成糖苷等方法进行，目前可以用于糖基化修饰的酶主要有三类：糖苷酶、二糖磷酸化酶和糖基转移酶。糖基转移酶通常定义为一类需要使用活化糖作为糖基供体的酶，这类酶通常负责将活性供体的糖单体部分转移到特异的受体，即糖苷配基上，从而形成特异的糖苷键。糖基转移酶仅采用少量的基本结构折叠，其中GT-A和GT-B折叠最为常见[3]。近年来，人们在研究糖基转移酶的结构特性和催化机理等方面取得了很多成果，例如，夏伟等通过PCR技术成功克隆了变形链球菌葡糖基转移酶中催化活性区(CAT)的基因片段并在大肠杆菌中获得其融合蛋白的表达,详细研究了变形链球菌葡糖基转移酶的结构特点并获得其催化活性区的基因片段[5]。Bernd Nidetzky等通过应用酶工程与合成生物学相结合的综合方法，比较一些已知的糖基化催化剂，详细阐述了勒罗瓦糖基转移酶生物催化合成糖苷的催化机理以及其发展为用于化学生产的糖基化的强大生物催化系统的进展和局限性[7]。戴新龙等在对于茶树中参与7-OH位点糖基化的类黄酮糖基转移酶的鉴定研究中，利用了三维结构建模、定点突变、高效液相色谱法、质谱等方法进行了一系列酶促分析及分离鉴定[8]。本次课题中，我们的研究对象为盐酸阿霉素酶法糖基化的糖苷产物，实验过程中，为防止酶失去活性从而不利于研究进行，所以我们首先优化表达条件，增强诱导糖基转移酶UGT BL1蛋白表达，之后对所得的糖苷产物进行分离纯化，再利用高效液相色谱法、质谱、核磁等方法对其结构进行进一步鉴定。对糖苷产物进行分离纯化我们可以采用大孔吸附树脂方法，并优化其梯度洗脱条件从而提高分离纯度。
大孔吸附树脂吸附分离技术是以大孔吸附树脂为吸附剂，利用其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选用适宜的吸附和解吸条件借以分离、提纯某一或某一类有机化合物的技术。该技术多用于工业废水的处理，维生素和抗生素的提纯、中草药化学成分等的研究，具有吸附快，解吸率高、吸附容量大、洗脱率高、树脂再生简便等优点[9]。本研究课题中利用大孔吸附树脂的选择性吸附和筛选作用，对盐酸阿霉素酶法糖基化所得糖苷产物进行分离纯化，并进一步优化吸附树脂梯度洗脱条件从而达到提高分离纯度的目的。质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。核磁共振波谱法（NMR)是利用核磁共振光谱进行结构测定、定性与定量分析的一种方法，现已广泛用于分析化合物结构、化学反应机理研究、药物成分研究等多方面的研究。因此，在本次研究中采用质谱分析与核磁共振波谱法共同鉴定，可更加准确及详细的分析鉴定糖基转移酶UGT BL1催化盐酸阿霉素所得糖苷产物的结构和性质。
2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案
1.本课题中，研究或解决的问题有：
以盐酸阿霉素为实验原料，通过糖基转移酶UGT BL1催化其发生糖基化反应，使其获得更优良的理化性质和生物学功能。在实验过程中通过不断优化反应条件，获得糖基转移酶UGT BL1蛋白诱导表达，利用大孔吸附树脂分离方法对催化所得糖苷产物分离纯化，并进一步通过优化大孔吸附树脂梯度洗脱条件达到节约成本、提高分离纯度的目的。然后将高效液相色谱（HPLC）运用到糖苷产物的结构鉴定中，同时结合质谱和核磁对其进行更加准确定性的分析。
2.我们准备采用的研究方法有定量分析、定性分析、正交比较的分析方法和HPLC、MS、NMR等实验手段。
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