1. 研究目的与意义
在全球新冠疫情的大背景下，寡核苷酸是近年来药物研究的热点，是治疗病毒、肿瘤和遗传病的基因靶向治疗药物。寡核苷酸通常是指含有10~50个碱基的RNA或DNA分子及其类似物。主要根据其药物作用的机制分为：干扰RNA (small-interfering RNAs, siRNAs)，反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）以及核酸适配体（Aptamer）等。
2. 课题关键问题和重难点
由于寡核苷酸具有强烈的负电性，在常规的反相色谱条件下保留较弱，所以需要在流动相中添加离子对试剂。强离子对试剂如季铵盐会使寡核苷酸产生强保留，但同时会削弱不同碱基疏水性差异对保留的影响，反而不利于寡核苷酸药物与杂质的分离。
保留时间的预测：由于组成寡核苷酸的核苷的疏水性各不相同，A和T的疏水性要大于C和G，所以长度或序列不相同的寡核苷酸在反相色谱中的保留时间也不同。
3. 国内外研究现状（文献综述）
通过对“寡核苷酸”、“纯化方法”、“离子对色谱法”、“反相”、“离子对反相色谱法”等关 键词进行文献检索，结果显示：寡核苷酸药物的分子量通常比较大，因为它们由较多的原子组成，包括核苷酸碱基、磷酸基团和五碳糖。这些组分在一起形成了一个复杂的分子体，分子量相对较大。此外，寡核苷酸药物中的磷酸基团带有负电荷，因此在水中它们以阴离子形式存在，并且通过相互作用形成负电荷聚集的分子体[1]。3.1其他纯化方法反相高效液相色谱：RP-HPLC纯化是一种常用的纯化方法，5’-O-三苯甲基保护基通常用于在寡核苷酸合成过程中保护5’-羟基。该方法可用于从较短的、未受保护的序列（“Triphenylmethyl ON ”序列）纯化全长寡核苷酸序列（“Trityl ON”序列）。然而，由于该方法需要进行额外的步骤来去除三苯甲基保护基，因此会增加整个纯化的成本和时间。此外，大规模RP-HPLC纯化过程可能昂贵，因为需要大量使用有机溶剂，并需要高度专用的设备，以处理高压需求[2][3]。离子交换色谱技术：离子交换色谱技术是纯化天然和合成寡核苷酸的一种常见方法。与RP-HPLC方法相比，离子交换色谱技术具有更低的成本和较低的压力要求。离子交换层析已成功地应用于寡核苷酸的纯化和制备规模。然而，由于富含鸟嘌呤的寡核苷酸可形成四链体二级结构，因此其庞大的尺寸和电荷使其在阴离子交换固定相上表现出广泛的保留，并且在某些情况下难以与阴离子交换固定相不可逆地结合[4]。3.2离子对反相色谱法离子对反相色谱法用于在使用不带电荷的反相或中性固定相的色谱柱上分离亲水或带电的纯化物。它包括通过与添加到流动相中离子对试剂的相互作用来改变带电纯化物的极性。这些试剂分子带有与寡核苷酸相反的电荷，它们能够与之形成静电键。纯化物和试剂离子之间形成的配对就像中性、疏水的分子，可以在C18柱上分离。离子对试剂也被称为离子配对添加剂，当含有离子对试剂的流动相流经色谱柱时，寡核苷酸与带相反电荷的试剂离子相互作用，形成中性复合物，可在非极性固定相上分离。在离子对反相色谱中，C18柱是最常用的色谱柱之一，小粒径色谱柱可以缩短扩散路径，从而抑制峰形展宽，更有利于分离。采用高分子骨架的色谱柱可以对偏碱性的流动相及较高的柱温条件更加耐受。除了传统的色谱柱之外，新型的色谱柱也被应用于寡核苷酸的纯化中。例如，聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）共聚物作为固定相的整体柱可以将修饰基团连接到不同碱基位点的寡核苷酸同分异构体进行成功分离。此外，结合离子交换和反相两种分离模式的色谱柱也可用于20个碱基左右的寡核苷酸的纯化，同时利用寡核苷酸的负电性和疏水性进行分离[5]。文献中发现在使用离子对试剂作为流动相时，分离仍以反相模式为主导。但如果使用离子交换色谱的条件（如NaCl溶液梯度洗脱），所得色谱图与使用反相相比差异相差巨大，这意味着此时可能是混合模式。因为寡核苷酸带有强烈的负电荷，在传统的反相色谱条件下难以充分保留，因此需要在流动相中添加离子对试剂以提高其保留能力[6]。在寡核苷酸药物纯化中，强离子对试剂如季铵盐能够增强寡核苷酸的保留，但却同时削弱不同碱基疏水性差异对保留的影响，反而不利于寡核苷酸药物与杂质的分离。因此，离子对试剂的选择及其在流动相中的浓度是寡核苷酸药物纯化中最重要的因素之一。目前，已经开发的离子对试剂只有少数几种是质谱兼容的，而其中研究最多、应用前景最好的离子对试剂为三乙胺（TEA）[7]。Apffel 等[8] 首次提出将酸性修饰剂六氟-2-丙醇（HFIP）作为离子对试剂和三乙胺（TEA）一起使用是1997年。这种方法具有分离选择性好、纯化时间短、样品用量少和溶剂消耗小等特点。通常通过离子对反相色谱法和含有TEA和HFIP的流动相来测定磷酸酯寡核苷酸的纯度和杂质分布。但是，TEA会影响质谱灵敏度，并且由于HFIP的腐蚀性和离子抑制作用会影响质谱仪的耐用性[9]。Studzicnska等[10] 为了寻找HFIP的替代品，研究者对离子对试剂（如TEA、三丙胺、己胺、二甲基丁胺、二异丙基乙胺、N，N-二甲基环己胺和辛胺）、HFIP和HFTP的缓冲体系进行了色谱和质谱比较。结果表明显示HFTP的脱盐能力比HFIP更好。但是不同序列的寡核苷酸适用于的TEA/HFIP比例各不相同，还需要通过实验进行优化[11]。目前最常用的混合离子对试剂主要包括三乙胺乙酸（TEAA）、三乙胺-六氟异丙醇（TEA-HFIP）以及三乙胺/丙胺-乙酸盐（TEA/PA-AA）等。为获得更好的纯化效果，对整个纯化系统进行了严格的清洁处理，以确保不能存在干扰离子。由于正四丁基乙酸铵（TBAA）不易获得，一些研究者尝试使用TEAA及TEA-HFIP作为离子对试剂，并减少流动相中有机相的初始洗脱比例。结果发现，这样做不仅提高了主峰与杂质峰的分离度，而且还改善了峰型。需要说明的是，因为三正丁胺是一种剧毒化学品，所以采购和使用都受到严格控制[1]。离子对反相色谱法是一种非常有效的寡核苷酸纯化方法。未来的研究方向包括开发新型固定相，更多的离子对试剂（尤其是可以提高MS检测灵敏度的离子对试剂），以及合理选择离子对类型和用量进行优化。随着国家对于危险化学品管制的加强，为了提高检测方法的通用性，需要尽量避免使用剧毒化学品。另外，反相离子对色谱法纯化寡核苷酸的分离机理和规律也将得到更多的揭示。考虑到企业研发生产成本以及效率，所选纯化方法适宜研发型企业获得高纯度寡核苷酸药物生产的前提，本文确定使用离子对反相色谱法进行接下来对寡核苷酸的纯化的实验。[1]陶炜. 粗寡核苷酸的纯化方法现状及进展[J]. 化工设计通讯，2022，48(06)：101-103.[2]Lin CY，Huang Z，Jaremko W，et al. High-performance liquid chromatography purification of chemically modified RNA aptamers[J]. Anal Biochem，2014(449)：106-108．[3]谭跃球，孙黎. 反相高效液相色谱法在分离纯化寡核苷酸合成物中的应用[J]. 湖南医科大学学报，1994(03)：277-278.[4]李红霞. 三种寡核苷酸纯化方法的比较[J]. 湖北农业科学，2012，51(14)：3065-3069. DOI：10. 14088/j.cnki.issn0439-8114. 2012. 14. 009.[5]骆雪芳，陈蓉，付静静，胡育筑. 反相离子对色谱法纯化3′，5′反向寡核苷酸[J]. 色谱， 2007(06)：814-819.[6]周海燕. 反义寡核苷酸药物在精准治疗中的应用进展及其作用机制[J]. 精准医学杂志，2020，35(04)：283-286 291. DOI：10. 13362/j. jpmed. 202004001.[7]SUN Y，NITTA S I，SAITO K，et al. Development of a bioanalyt-ical method for an antisense therapeutic using high-resolution mass spectrometry[J] . Bioanalysis ， 2020，12( 24): 1739-1756.[8]APFFEL A，CHAKEL JA，FISCHER S，et al. Analysis of oligo-nucleotides by HPLC-electrospray ionization mass spectrometry[J].Anal Chem，1997，69(7) :1320-1325.[9]翁国锋. 基于质谱技术的寡核苷酸分离纯化方法研究[D].浙江大学，2019.[10]STUDZICNSKA S，CYWONIUK P，SOBCZAK K. The role offlu-oroalcohols as counter anions for ion-pairing reversed-phase liquid chromatography / high-resolution electrospray ionization mass spec-trometry analysis of oligonucleotides [J]. Rapid Commun Mass Spectrom ，2019，33( 7):697-709.[11]杨洪淼，范慧红. 反相离子对色谱法对寡核苷酸药物纯化的进展[J]. 中国生化药物杂志，2015，35(07)：161-164.
4. 研究方案
在反相离子对色谱中，流动相的 pH 值、离子对试剂的种类和浓度、有机溶剂的种类和浓度、缓冲液、柱温等因素都会对分离效果产生很大的影响。
柱平衡：柱子必须与离子对试剂充分平衡，以确保其在固定相上的吸附。
5. 工作计划
第一阶段：查阅大量文献，认真阅读，确定论文题目；
第二阶段：根据论文题目进行调研，按照指导教师所下任务书以及选题的具体要求，积极做好论文前期准备工作；
第三阶段：完成开题报告。通过开题报告，对论文的框架和内容有一个大体的构思，并在指导老师的帮助下，整理相关资料、补学空白知识点，做好撰写论文的前期准备工作；
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