1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
马链球菌兽疫亚种（Streptococcusequissp.zooepidemicus，SEZ）属于兰氏分群的C群链球菌，可以导致多种动物疾病，引起败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎等。马链球菌兽疫亚种是引起猪链球菌病（Swinestreptococcosis）的主要病原之一，在20世纪70~80年代，从我国各地发生猪链球菌病的病猪中分离的链球菌株，多数为本菌[1]。近年来，我国的养猪业仍旧因此遭受严重的经济损失[2]。人类食用被该菌污染的猪肉或者接触患病的猪也会被感染[3]，表现为脑膜炎、菌血症、急性肾炎、化脓性关节炎、肺炎等，严重者甚至死亡[4-7]。尽管马链球菌兽疫亚种导致人细菌性脑膜炎的发病率和死亡率很高，其发病机理仍不完全清楚[8]。
马链球菌兽疫亚种产生主要成分为透明质酸（Hyaluronicacid）的荚膜，由hasABC操纵子编码，这种荚膜具有抗吞噬作用，并有助于粘附HeLa等细胞[9、10]。尽管荚膜缺失株的抗吞噬能力显著降低，但是乳房链球菌的缺失并不影响感染和乳腺炎的发生[11]。猪链球菌荚膜缺失株由于能更充分的暴露细胞壁成分，在细菌黏附和侵入细胞方面与野毒株有显著差异[12]。马链球菌兽疫亚种荚膜缺失株对研究该菌导致脑膜炎的致病机理方面具有重要意义。
基质金属蛋白酶（MMPs）是能够参与破坏细胞外基质的酶类中最重要的蛋白水解酶，在肿瘤的侵袭、转移过程中发挥重要作用[13]。尤其是MMP-9，可以酶解多种基质蛋白质，如纤连蛋白，层粘连蛋白和第四型胶原蛋白等。越来越多的证据表明，MMP在脑膜炎的发生中有重要作用[14]。MMP-9介导的血脑屏障通透性增加可能会导致病原体向中枢神经系统的迁移，从而导致进一步的损伤[15]。因此通过马链球菌兽疫亚种刺激细胞分泌的MMP-9进行研究，可以进一步了解该菌导致脑膜炎的致病机理。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：探究马链球菌兽疫亚种荚膜的功能，研究马链球菌兽疫亚种荚膜缺失株对细胞的粘附能力及刺激细胞分泌MMP-9的能力与野生株的差异。
研究内容：用马链球菌兽疫亚种野生株C55138、荚膜缺失株C55138△HasB与鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）、鼠巨噬细胞（RAW264.7）和人喉癌细胞（HEp2）共同孵育，随后对细胞内外细菌及细胞本身进行荧光染色，并利用激光共聚焦显微镜进行直接观察，完成马链球菌兽疫亚种对脑微血管内皮细胞粘附能力的研究；并进行定量ELISA测定细胞因子MMP-9的分泌水平，探究荚膜缺失株与野生株刺激MMP-9分泌能力的差异。
3. 研究的方法与方案
研究方法：用马链球菌兽疫亚种野生株C55138、荚膜缺失株C55138△HasB分别侵染鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）、鼠巨噬细胞（RAW264.7）和人喉癌上皮细胞（HEp2）。对细胞内外细菌及细胞本身进行荧光染色，并利用激光共聚焦显微镜观察，从而探究马链球菌兽疫亚种荚膜对细胞的粘附能力的影响。并在细菌、细胞孵育后，取细胞上清，测定细胞MMP-9的分泌的差异，从而探究该菌荚膜对诱导细胞分泌细胞因子MMP-9的作用。
技术路线、实验方案：
（一）免疫荧光染色
4. 研究创新点
猪链球菌的荚膜功能及其荚膜缺失株与野生株的粘附、侵袭能力等的不同有过报道，但是马链球菌兽疫亚种方面很少有相关研究。本实验以马链球菌兽疫亚种及其荚膜缺失株为研究对象，探究该菌的荚膜功能，对研究马链球菌致脑膜炎相关致病机理有一定的意义。
5. 研究计划与进展
2014.2.24-2014.3.31熟练细胞培养技术，试剂的选择及配制，通过预实验选取最佳的试剂（包括抗全菌血清，带有荧光标签的二抗，细胞染料等）稀释浓度，以及各试剂最佳的作用时间。细菌标准曲线的测定。
2014.4.1-2014.5.2将培养至对数期的细菌侵染细胞后，对细胞内外细菌及细胞本身进行荧光染色，并利用激光共聚焦显微镜观察，选取典型图片保存；细菌、细胞孵育后取细胞上清液，进行定量ELISA测定MMP-9的分泌。
2014.5.3-2014.5.22论文撰写
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