1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
自1918年西班牙流感大流行已逾一世纪，而流感病毒对人类的影响却从未削减。据统计，全球每年有6-12亿人次患流行性感冒，有50-100万人死于该病。流感病毒的感染往往伴随着呼吸类细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球等）的继发感染，进而增加患者的发病率和死亡率。对于犬这一宿主来说，当犬被流感病毒感染时，同样可能引起呼吸道致病菌的继发感染。
自从2004年马源H3N8亚型犬流感在美国爆发，引起人们极大的关注，改变了此前人们认为的观点，即犬对流感病毒具有抵抗力的观点。2007年，H3N2亚型的犬流感病毒在韩国首次报道，随后，在中国陆续分离到此亚型的犬流感病毒。2009年我国报告犬感染H1N1亚型流感病毒，基因序列分析表明该病毒与当时人群中流行的甲型H1N1流感病毒同源性高达99%。流感病毒通过在犬等哺乳动物体内的适应可能会更容易获得感染人的能力，由于犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，犬有可能会作为中间宿主将流感病毒传播给人类，因此犬流感病毒具有广泛的公共卫生学意义。国外研究也证实H3N8、H5N1以及H3N2亚型流感病毒可跨越品种障碍而感染犬，H3N8、H3N2亚型CIV还可以在犬群中水平传播。虽然尚未证实犬在人类流感病毒演变过程中的作用，但在宠物犬中检测得到甲型H1N1流感病毒，足以引起研究人员的重视。
伪中间葡萄球菌国内外的研究并不多，为凝固酶阳性，已经被确认为各种动物（包括狐狸、鸽子、貂、马、猫、狗等）皮肤和粘膜的正常菌群。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：通过研究犬流感病毒和葡萄球菌在Balb/c小鼠上通过滴鼻的方式协同感染，在五个不同的时间点：24h、48h、72h、96h、120h，进行临床症状的观察、体重的检测，细菌载量和病毒载量的测定，进而为犬流感病毒和葡萄球菌在犬上感染的研究以及临床治疗提供指导。
研究内容：
1、小鼠模型
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1） 葡萄球菌和犬流感病毒的复苏和培养
① 葡萄球菌：从血平板上挑取单菌落，37℃摇床，LB培养过夜，次日转接培养4-5小时，测OD值达0.6左右即可，6000rpm离心10min，弃上清，用PBS重悬，再离心，如此三次。然后测OD值，调节到指定浓度，待用。
② 犬流感病毒：将病毒接种到状态良好的细胞上，37℃孵育72小时，空斑实验测定病毒的毒力。
（2） 接种Balb/c小鼠
第一天以滴鼻的方式接种犬流感病毒，80L，10^5 (PFU/mL)。第四天以滴鼻的方式接种葡萄球菌，50L， 2*10^10（CFU/mL）。
（3） 临床症状观察
从接种病毒当天起，观察小鼠的临床症状，称其体重，在攻完病毒24h、48h、72h、96h、120h，这五个时间点取病变组织4*4mm，于固定液中保存，待制作病理切片观察组织病变。
（4） 细菌载量的测定
①用高压过后的毛细管从小鼠的外眼角取血约800L，分别做10-1、10-2、10-3，三个稀释度，三个重复涂LB平板。
②在超净台取出脑、肺和脾，用PBS冲洗表面，装入5mLEP管称重后加2mL PBS为研磨液，研磨之后，做两个稀释度，原液和稀释液，做三个重复涂板子，进行细菌计数。
37℃温箱培养18h，计数，并计算血液和脏器的CFU。
（1） 病毒载量的测定
① 组织病毒RNA的提取
用EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取RNA。
② 一步法RT-PCR
③ 荧光定量PCR
实验方案：
本实验分为4组：PBS对照组、病毒组、细菌组和病毒细菌互作组，分别从临床症状、细菌载量和病毒载量三个方面进行研究。
技术路线：
病毒、细菌滴鼻 五个时间点取样 病理切片 平板计数 荧光定量PCR
4. 研究创新点
（1）目前，国内没有文献记载流感病毒和葡萄球菌的协同感染方面的研究。
（2）对研究犬的呼吸道疾病的传播和治疗有重大的意义。
5. 研究计划与进展
研究计划：复苏病毒和细菌，Balb/c小鼠滴鼻接种病毒，第三天滴鼻接种细菌，接下来五天，观察小鼠的临床症状，体重变化，细菌载量和病毒载量的测定
预期进展：前期：查找文献，学习方法。进行预实验，探究病毒和细菌的最适宜浓度，熟悉实验方法，完善实验操作，总结经验教训。
中期：进行正式实验。
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