1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
一、犬巴贝斯虫病简述和国内外研究进展
犬巴贝斯虫病是由梨形虫目（Piroplasmida）、巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia）的犬巴贝斯虫（B.canis）、吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）和韦氏巴贝斯虫（B.vogeli）寄生于犬的红细胞内引发的一类发热性、蜱传性血液原虫疾病。该病对犬的危害性仅次于病毒性传染病。患病犬常表现贫血、发热、黄疸、血红蛋白尿、可视粘膜苍白等症状，有些甚至因溶血性贫血、缺氧性损伤等而致衰竭死亡。
1.传播方式
2. 研究的基本内容和问题
二．研究目标：用血液采集卡收集云南玉溪地区贫血犬的血液样品，通过实验室PCR、酶切、测序方法，来判断该病的流行状况。
三．实验内容和拟解决问题
1.临床病理血样收集；
3. 研究的方法与方案
1.血样采集 血液样品采集自云南玉溪地区病犬。犬外侧隐静脉采血，EDTA抗凝，4℃保存，将血液滴加于血样采集卡。2.犬血液基因组DNA提取 剪下大小为3*3mm的血片置于1.5ml离心管中。加入细胞裂解缓冲液450 L，加入10 μL蛋白酶K，56 ℃水浴1 h；加入Tris酚-氯仿抽提缓冲液500L，上下颠倒混匀；15 ℃，12000 r/min离心5min，取上清液置于新的离心管中；加入1 mL无水乙醇，上下颠倒混匀，15 ℃，12000 r/min离心5 min，弃上清；加入1 mL 70%乙醇，混匀，15 ℃，12000 r/min离心5 min。倒净乙醇，加入100 LddH2O溶解DNA，-20 ℃保存备用。3.引物设计 根据犬巴贝斯虫18S rRNA基因设计的犬吉氏巴贝斯虫和犬巴贝斯虫通用引物: 上游引物：5 ′-GTCTTGTAATTGGAATGATGGTGAC-3′ 下游引物：5 ′-ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA-3′4.PCR反应 25μl PCR反应体系组成：TaKaRa Taq 12.5μl，10PCR Buffer(Mg2 Plus) 2.5μl，dNTP Mixture 2μl ,20μM上下引物各1μl，模板DNA 2.5μl，补水至25μl。 PCR循环参数：94℃,预变性5min；94℃ 变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，重复10个循环，每个循环退火温度降0.5℃；然后94℃变性15s,55℃退火30s，72℃延伸1 min，重复25个循环；最后72℃延伸5 min。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。5.PCR产物限制性酶切鉴定 按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的所述方法，取纯化后的PCR产物10 μL于新的离心管中，加入双蒸水7.5μL，10缓冲液2.5μL，限制性内切酶HinfⅠ1μL，混合均匀，37℃，酶切2 h，然后用10％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶切产物。
4. 研究创新点
本研究通过血液采集卡来收集异地的血液样品，极大的减少了样品的储存、运输成本。通过实验室的PCR诊断、酶切测序的方法，从而研究出云南玉溪地区犬巴贝斯虫病的流行情况。
5. 研究计划与进展
2013.10-2013.12：在实习医院实习并收集云南玉溪地区贫血犬血液样本。
2013.12-2014.1:PCR诊断疑似病例。
2014.2-2014.4:病例分析。
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