1. 研究目的与意义
研究背景：
从联苯污染土壤中分离的恶臭假单胞菌株B6-2可以代谢降解多种芳香族化合物，包括美国环境保护局规定的13种优先控制的PAHs污染物。菌株B6-2是一种生物安全菌株，可用于环境生物技术和环境修复。菌株 B6-2 具有通过多样化的方式代谢多环芳香化合物的特性，这种特性对于环境中广泛存在的这些模式化合物的烷基化或卤素衍生物的降解具有重要作用。菌株B6-2是在复合污染的生物修复中具有潜在应用价值，同时是研究恶臭假单胞菌的生物化学、遗传学和进化方面的潜在研究模型。
毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin system, TA）是广泛存在于细菌和真菌细胞内的一对小型遗传控制元件，毒素基因编码稳定的蛋白质分子，抗毒素基因编码的是稳定性较差的蛋白质或是具有调控功能的RNA。TA初发现在大肠埃希菌F质粒中，但很长一段时间人们还未研究透彻，只认为TA的作用就是维持质粒的稳定，并没有引起人们的重视。在近年来，人们对TA的生化活性、作用机制、毒素活性调控以及它的功能等方面研究取得了重大进展，TA的研究主要集中在肠道细菌和病原菌中，其中II型TA研究最为深入和广泛。研究人员通过能够预测II型TA的在线软件和生物信息学分析方法，发现了TA的存在。TA系统的生理功能有①应激应答：是TA系统最主要的功能，抗生素作用、营养物质缺乏、DNA受损伤等条件可以激活TA系统。②诱导程序化细胞死亡：可以维持细菌种群的稳定性、防止扩散的噬菌体感染正常细胞、通过清除缺陷型细胞或者发生突变来维护基因组的稳定性。③形成多重耐药性：一种观点使细菌长期使用抗生素培养，会激活TA系统，使细菌处于休眠或类休眠状态，在一定程度上停止了新陈代谢，需要依赖抑制转录和翻译的抗生素，从而导致多重耐药性的形成。另一种观点是TA系统可能诱导细菌形成对细菌有屏障保护作用的生物被膜，增强了细菌的耐药性。④防止DNA丢失和防止外源DNA入侵：TA系统可以维持细菌体内质粒的稳定，同时也可以防止外源质粒和噬菌体的入侵。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
通过基因敲除构建relE缺失突变株和relBE缺失突变株，再将报告质粒导入菌体，通过β-半乳糖苷酶法测定启动子活性实验来研究relBE系统的调控方式。
3. 研究的方法与步骤
(1) 重组片段的获取：根据恶臭假单胞菌B6-2基因组，克隆目标基因上下游的片段，进行重组连接并通过PCR扩增；利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物，若成功，则进行PCR产物的回收。
(2) 构建重组质粒：按照试剂盒上的说明方法，提取质粒；将质粒酶切后切胶回收，在紫外灯下找到酶切片段，回收质粒酶切产物；将目的基因的上下游片段与线性化的质粒用诺唯赞试剂盒进行重组；制备感受态细胞进行转化实验；挑选转化子并用电泳验证。
4. 参考文献
[1] Premnath N, Mohanrasu K, Rao R, et al. A Crucial Review on Polycyclic Aromatic Hydrocarbons - Environmental Occurrence and Strategies for Microbial Degradation[J]. Chemosphere, 2021, 280(2):1-14.
[2] Weimer A, Kohlstedt M, Volke D.C. et al. Industrial biotechnology of Pseudomonas putida: advances and prospects[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2020, 104:7745–7766.
5. 计划与进度安排
一、查阅文献，写出开题报告（3月6日前完成）
根据论文题目，查阅正式出版的中外学术期刊和专著，从中选择10篇以上参考文献（外文1-2篇或以上），认真阅读，深刻理解，综合分析，掌握其最新动态，参照论文设计任务书的研究内容，写出开题报告。如参考文献要列出作者姓名、论文标题、发表刊物、时间、卷（期）及起止页码。在查阅的文献中选1篇外文（文献内容要结合本研究内容）全文翻译为中文。
二、实验研究前期准备工作（3月20日前）
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