1. 研究目的与意义
研究背景：有机溶剂有严重破坏微生物正常生理功能的毒害作用，而细胞膜是溶剂毒性作用的主要靶点。1989年，关于菌种Pseudomonas putida的有机溶剂耐受现象的报道，开辟了人们对有机溶剂耐受机制理解的纪元。耐有机溶剂微生物是一类新颖的极端微生物，它们通过各种耐受机制，有效抵御或降低有机溶剂对其细胞产生的毒害作用，机制包括：囊泡外排、改变细胞膜磷脂结构组成、有机溶剂外排泵、改变细胞比表面积等，而其中以有机溶剂外排机制为最重要。在恶臭假单胞菌中存在的有机溶剂外排泵主要有：TtgABC、TtgDEF、TtgGHI。在恶臭假单胞菌株B6-2中有两个外排泵TtgABC和TtgGHI均参与对有机溶剂的外排。
在微生物群体中有很少一部分在一些压力跟不利生长的环境下会处于一个不分裂增殖的休眠状态，通过这种方式来维持细胞自身的存活，被称为持留菌。简单来说，就是在环境到一个十分恶劣的情况下，细胞会进入休眠的状态，它们的理化性质会相较于平常更为稳定。当这种逆境消除后或外界的毒害物质的浓度降低后，持留菌就又可以恢复生长，并进行分裂增殖和再生。但是值得注意的是，持留菌并不是抗性突变，它们只是一类表型异化的群体，它们的子代细胞并不具有对抗生素或有毒物质相应的抗性，它们与基因突变体获得高度抗性不同。
细菌的持留现象被发现的很早，在20世纪40年代就被发现，但是因为持留菌自身形成机制复杂，对环境不应答等多种特性，给持留菌的研究带来很大的难题。直到80年代的时候，Moyed等才开始对持留菌从分子水平上进行研究。人们发现毒素-抗毒素系统的作用机理是分子水平上一种非常重要的介导持留菌产生的原因。该系统是依赖于不稳定的抗毒素。在某些应激条件下，抗毒素被蛋白酶降解，毒素被释放后会妨碍或干扰细胞的DNA复制、ATP合成，从而导致细胞凋亡或者休眠。
2. 研究内容和预期目标
主要内容：恶臭假单胞菌B6-2是能够以联苯为唯一碳源生长的革兰氏阴性菌株，其通过共代谢方式降解各种多环芳烃和二恶英类化合物，即使在复杂的环境中都能有良好的适应能力，这得益于其染色体上存在的两个RND型外排泵TtgABC和TtgGHI，它们赋予菌株多药抗性和有机溶剂耐受性。
本研究利用高浓度四环素诱导菌株进入持留状态，通过比较野生菌与外排泵缺陷菌株形成持留菌能力的差异，探究菌株B6-2的外排泵TtgABC和TtgGHI与持留性的关系。
3. 研究的方法与步骤
开启超净工作台的紫外线灯，等待30分钟。30分钟后关闭紫外线灯，打开排气扇与照明灯。分别取过夜培养的野生菌B6-2、B6-2#8710;ttgGHI、B6-2#8710;ttgABC、B6-2#8710;ttgV、B6-2#8710;ttgR这五种菌株按1%转接至新鲜的LB液体摇管中，置于30℃恒温震荡培养箱中培养4小时及以上。再分别取25微升四环素放于培养后的这五种摇管中，置于30℃恒温震荡培养箱中培养12 h。分别在培养4 h、6 h、8 h取样，并分别取这五种菌液100微升，加入900微升生理盐水，稀释至10-1原液浓度，按此方法稀释得到七个浓度梯度，分别为10-1原液浓度、10-2原液浓度、10-3原液浓度、10-4原液浓度、10-5原液浓度、10-6原液浓度、10-7原液浓度。再取3微升稀释后的菌液，合理规划培养皿区域，将其滴于培养皿中。其余菌液放入30℃恒温震荡培养箱中培养，培养基放入30℃恒温培养箱中培养（实验操作过程于超净工作台中完成）。
4. 参考文献
[1] Bansal V, Kim K H. Review of PAH contamination in food products and their health hazards[J]. Environment International, 2015, 84:26-38.
[2] 杜静怡, 王铖, 郭君慧, 等. 细菌RND外排泵的结构与作用机制研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2022, 47(10):8.
[3] Taylor D L, Bina X R, Bina J E, et al. Vibrio cholerae vexH Encodes a Multiple Drug Efflux Pump That Contributes to the Production of Cholera Toxin and the Toxin Co-Regulated Pilus[J]. Plos One, 2012, 7(5):e38208.
5. 计划与进度安排
一、查阅文献，写出开题报告（3月6日前完成）
根据论文题目，查阅正式出版的中外学术期刊和专著，从中选择10篇以上参考文献（外文1-2篇或以上），认真阅读，深刻理解，综合分析，掌握其最新动态，参照论文设计任务书的研究内容，写出开题报告。如参考文献要列出作者姓名、论文标题、发表刊物、时间、卷（期）及起止页码。在查阅的文献中选1篇外文（文献内容要结合本研究内容）全文翻译为中文。
二、实验研究前期准备工作（3月20日前）
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