1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
课题意义：牛奶营养成分丰富，含有钙、磷、铁、锌、铜、锰和钼等，且钙磷比例非常适当，利于人体对钙的吸收，是人类最好的钙源之一。奶牛是牛奶产生的源泉，是牛奶供应的物质载体，随着生活水平的提高，人们对乳品质的要求越来越高，因而奶牛身体健康，特别是奶牛乳腺健康，已成为重要的研究方向。乳腺炎是奶牛养殖行业中造成经济损失最大的疾病之一，是影响奶牛经济价值的重要因素，会直接或间接造成经济损失[1]，现已严重影响世界乳业的发展。
乳腺炎是一种由多种特定病原微生物引起的疾病，例如，真菌、细菌、病毒以及霉形体等。奶牛乳腺炎，指乳房实质与间质的炎症，主要表现为乳房红、肿、热、痛，乳汁出现异常，泌乳量呈现出下降趋势，甚至停止泌乳。一般情况下，可将奶牛乳腺炎分为两种基本类型，即临床型与隐性型。临床型为乳房间质、实质或间质实质组织的炎症，以乳汁变性为主要表现，乳房组织伴有不同程度上的肿胀、疼痛和温热，若以病程和病情为依据，可将其划分为最急性、急性、亚急性和慢性四种。隐性型又称亚临床型乳腺炎，无典型症状，肉眼无法观察到乳房及乳汁的异常，但是，乳汁的理化性质已经发生变化。侯宝柱等[1]研究发现在感染奶牛乳腺组织中金黄色葡萄球菌和无乳链球菌是主要的传染性微生物。而另一方面，牛的居住环境是引起乳腺炎病原菌的主要来源。主要的致病菌有无乳链球菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌[2]。
国内外研究概况：长期以来，国内外主要是应用抗生素，抗菌药和化学合成药物，虽然发挥了重要作用，也带来了一系列问题，如耐药菌的增加、抗生素残留造成的有抗奶等，严重影响了奶牛业的健康发展和人类的健康。李会等[3]研究发现，复方阿莫西林乳房注入剂在临床型乳腺炎的治疗中有较好效果。王凤等[4]研究认为，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及链球菌对恩诺沙星、氧氟沙星、复方新诺明和甲氧苄啶较敏感，可作为治疗奶牛乳腺炎的首选药物。徐鹏等[5]试验证明磷酸吡利霉素在隐性乳腺炎的治疗中效果明显。虽然抗生素对人类疾病的预
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：探讨褪黑素对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞活力、凋亡和炎性因子的影响，为褪黑素在奶牛乳腺炎的防治提供理论依据。
研究内容：试验主要通过角蛋白-18鉴定奶牛乳腺上皮细胞，通过CCK-8测定褪黑素对LPS诱导的乳腺上皮细胞活力的影响，通过mRAN水平和Western Blot 技术测定褪黑素对LPS诱导的乳腺上皮细胞内炎症因子的影响。
拟解决的关键问题：通过测定细胞活力及炎症因子的表达，测定褪黑素是否可以缓解奶牛乳房炎症的发生。、
3. 研究的方法与方案
研究方法：
（1）奶牛乳腺上皮细胞的培养
本试验采用组织块法体外培养奶牛乳腺上皮细胞。屠宰健康泌乳的荷斯坦奶牛，利用无菌术获得乳腺组织，经PBS缓冲液（含双抗）冲洗后带回实验室；切开乳腺组织，选择富含乳腺小叶的部位进行剪切，获得乳腺组织块，经PBS缓冲液（含双抗）及75%酒精反复冲洗后，将组织块置于装有PBS缓冲液（含双抗）的烧杯拿进无菌细胞间；组织块再经75%酒精浸泡30s、PBS缓冲液（含双抗）冲洗三遍后，置于一次性培养皿中拿进超净工作台，在酒精灯下严格操作。
4. 研究创新点
本试验拟以健康的、处于泌乳期的中国荷斯坦奶牛的奶牛乳腺组织为试验材料，对褪黑素对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞活力、凋亡和炎性因子的影响进行系统分析，有望首次在奶牛乳腺炎的防治领域找到新的可以代替抗生素的有效成分，其研究成果将对奶牛乳腺炎的防治问题有一定的影响作用。
5. 研究计划与进展
2017.09-2017.11 文献检索，制定初步试验方案，学习相关实验技术
2018.03-2017.04 进行细胞培养和具体试验处理
2017.04-2017.05 对试验数据进行统计分析
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