1. 研究目的与意义
现今社会人口老龄化加速，骨质疏松症危害着中老年人的健康，已成为一个严重的社会问题。骨质疏松症是一种骨代谢疾病，它是以骨微细结构破坏、低骨量、骨折风险增加为特点，表现为骨强度下降、易发生脆性骨折[1]。研究发现，各种类型的骨质疏松发病过程中都伴随着氧化应激水平的升高[2]。氧化应激是细胞内的抗氧化系统不足以清除产生的活性氧的一种不平衡状态，会对细胞产生不利影响。生理水平的活性氧对于保持正常的成骨细胞功能是有益的，但是当细胞内的活性氧过度积累时，氧化应激将对成骨细胞造成严重危害，并将导致骨质疏松[3]。
腺苷酸激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)是由催化亚基α、调节亚基β和γ组成的异源三聚体蛋白，负责维持细胞三磷酸腺苷(Adenosine-triphosphate, ATP)产生与消耗之间的平衡[4]，被认为是一种代谢应激传感酶，在调节细胞和全身能量稳态中起着重要作用。目前认为AMPK的活性主要受细胞中AMP/ATP比率的调节, AMP/ATP比率升高，则AMPK被激活，AMPK被激活后，对保护成骨细胞免受氧化应激的损害发挥重要作用[5]，提示AMPK信号通路有望在骨质疏松疾病的骨代谢中发挥关键作用。
近年来，人们发现从动物或植物中提取的肽具有多种生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗炎和抗癌活性。动物或植物蛋白质是很好的蛋白质来源，可以水解成生物活性肽，如抗氧化肽[6]。小麦胚芽有“天然营养宝库”之称，含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和膳食纤维，以及一般谷物产品中缺乏的赖氨酸和苏氨酸等。此外，还含有谷胱甘肽、凝集素、二十八烷醇和黄酮等多种对人体具有特殊生理功能的营养成分，极大的提高了小麦胚芽的附加值。作为“功能性食品”的代表，小麦胚芽被证实具有抗氧化、降胆固醇、降高血压和抗癌等功效[7]。在本研究中，我们筛选出了一种可以缓解骨质疏松的小麦胚芽肽ADWGGPLPH（AOP），且已经研究出这个活性肽可以在高糖诱导的糖尿病小鼠中，激活AMPK，从而减少氧化应激[6]。本项目采用体外培养MC3T3-E1细胞模型，以H2O2诱导氧化应激，使细胞异常，建立起MC3T3-E1细胞氧化应激模型再用小麦胚芽肽AOP干预，从细胞增殖率、细胞凋亡率和细胞氧化应激水平等不同方面来探究ADWGGPLPH对H2O2诱导的MC3T3-E1氧化应激的保护作用，旨在探究小麦胚芽肽ADWGGPLPH减少成骨细胞氧化应激的机制，这将为小麦胚芽抗氧化肽开发成抗氧化功能性食品或药物提供重要的理论依据[8]。2. 研究内容和预期目标
（一）研究内容
本实验所使用的AOP是从麦胚蛋白中酶解所得[6]。以H2O2诱导成骨细胞发生氧化应激反应，使用小麦胚芽肽进行干预，将体外培养的MC3T3-E1细胞，分化为成骨细胞，分为空白对照组、H2O2组(200μmol)、H2O2 AOP 20μmol组、H2O2 AOP 30μmol组、H2O2 AOP 40μmol组。MTT检测各组细胞增殖活性，用结晶紫染色观察成骨细胞的生长状态，流式细胞仪检测细胞凋亡率；Hoechst染色实验观察细胞凋亡；荧光探针法检测细胞活性氧(ROS)水平；试剂盒检测GSH-Px、SOD、MDA水平，观察小麦胚芽肽ADWGGPLPH对成骨细胞增殖和凋亡的影响；WesternBlot测定AMPK, P-AMPK等蛋白表达量，讨论小麦胚芽肽ADWGGPLPH减少成骨细胞氧化应激的机制。
（二）拟解决的关键问题
3. 国内外研究现状
人类栽培小麦历史悠久，种植广泛程度亦居各谷物首位。小麦适应范围广泛，全球各纬度、各海拔均有种植，是与人类密不可分的重要粮食作物之一[9]。我国的小麦总产量占世界第一位，年总产量约为1.10亿吨，可以开发利用的小麦胚芽约280~420万吨[10]。目前对于小麦胚芽的利用，主要集中在三个方面[11]：第一，大部分小麦胚芽被混入麸皮中当作饲料来用，造成资源的极大浪费；第二，直接加到食品中，比如麦胚烘烤食品、汤料、休闲小食品等；第三，提取小麦胚油，现在还处于起步阶段。脱脂后的麦胚又被用作饲料廉价出售。小麦胚芽没有得到合理利用，主要原因是对小麦胚芽的研究开发尚停留在营养源水平上，对于其保健功能研究不够深入。
为了更好地利用小麦胚芽这一宝贵的食品资源，国内外食品工作者大力加强对小麦胚芽的综合利用的研发[12]。如今，小麦胚芽已得到了较广泛的利用[13]。近年来，国内外对小麦胚芽卓越的营养保健功能研究日益深入，从胚芽油、胚芽蛋白等大方向细化到其中具体组分，研究的针对性越来越强。广东医科大学研究发现[14]，把辅酶Q与小麦胚芽油一起组成复合制剂，其抗氧化，促进成骨细胞形成的作用明显增强，抗骨质疏松的作用特别明显，对骨质疏松有更好的预防作用。ZHU等[15]采用碱性蛋白酶酶解小麦胚芽蛋白，并对小麦胚芽蛋白水解物 ( WGPH ) 采用多种体外方法测定其抗氧化能力，结果表明WGPH具有清除自由基如DPPH、O2-和OH的活性。由此可见小麦胚芽肽作为抗氧化功能因子用于保健食品开发有巨大的潜力，也希望在不久的将来把小麦胚芽提取物发展成为新型的创新药物，功能性和保健食品，为广大的小麦粉厂带来明显的经济效益和社会效益。4. 计划与进度安排
2022年11月-2022年12月：确定选题，收集查找相关资料，了解国内外研究进展状况、课题的可行性以及意义等，制定论文全部工作的计划表。
2022年1月-2022年2月：拟写开题报告，整理文献资料。
2022年3月-2022年4月：建立MC3T3-E1细胞氧化应激损伤模型，并以不同浓度的ADWGGPLPH分组喂养细胞，观察细胞生长状态并测定各项指标，对数据进行统计学分析。
5. 参考文献
[1] COMPSTONJE, MCCLUNG MR, LESLIE WD. Osteoporosis. Lancet. 2019; 393(10169): 364-376.
[2] 郭宝磊, 杨茂伟, 梁单, 等. 过氧化氢通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡[J]. 中国老年学杂志, 2013,33(22): 5661-5663.
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