1. 研究目的与意义
大肠杆菌（Escherichiacoli）是人和动物肠道内广泛存在的革兰氏阴性菌【1】，是肠道内的正常菌群，但极易造成食品污染，在一定条件下还可引起肠道外感染。因此常以大肠杆菌作为食品检验中的粪便污染指标菌，从而反映对人体健康危害性的大小。
在食品加工贮藏过程中，为保证食品质量，必须采取有效措施来控制有害微生物。在此过程中大肠杆菌的生长会受到各种不良条件的威胁。其中高温是实践中最常用、最方便的物理灭菌因素之一【2】。本研究旨在分析不同热胁迫和培养温度对大肠杆菌细胞膜特性的影响，对于更好的确定食品加工过程中热处理的条件，保障食品生产加工安全有重要意义。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
大肠杆菌是食品中一种常见的污染菌，常受到食品生产过程中热处理条件的作用。热处理过程中高温对微生物的致死作用，主要是它可以引起蛋白质、核酸和脂质等重要生物高分子发生降解或改变其空间结构等。组成微生物细胞膜的主要成分是磷脂，细胞膜是由两层磷脂分子整齐地对称排列而成的。【3】为了分析磷脂的相变特性，采用差式扫描量热法( Differential ScanningCalorimetry)【4】。该方法使用的温度范围较宽，灵敏度高，样品用量少，省时易操作，实验重复性好，【5】在生物科学研究中具有广泛的应用前景。【6】通过分析磷脂的相变特性可以研究大肠杆菌细胞膜的相变特性。细胞膜特殊的磷脂双分子层结构以及半透性膜功能在生物体生长发育过程中起重要作用，所以大肠杆菌细胞膜的相变特性会对大肠杆菌耐热性造成影响。该研究有助于优化食品生产过程中热加工的条件。
3. 国内外研究现状
微生物具有极其灵活的适应性或调节代谢机制，除遗传因素的影响外，微生物的耐热性还受到环境因素的影响。【7】近年来微生物对于不良环境的适应性及其作用机制引起了研究者的广泛关注。研究发现，微生物面对不适宜其生长繁殖的环境条件，其生理代谢会做出应激反应，这种对不良环境的适应使其能够生存下来。【8】有研究表明温度过高会引起微生物体内蛋白质和酶失活、细胞膜破坏以及DNA和RNA 等生物大分子的降解，但一定的热处理和培养温度可以增强微生物的抗热性。【9】
4. 计划与进度安排
大肠杆菌（Escherichiacoli O157:H7 ATCC 43889）接入胰蛋白胨大豆肉汤（Trypticase Soy Broth，TSB）液体培养基，140r/min 摇床振荡培养18 h至稳定期。取分别于10℃、28℃、36℃、45℃下培养的稳定期ATCC 43889细胞培养液各800ml，以及分别经50℃、60℃、70℃反复多次热胁迫处理后于36℃培养的稳定期ATCC 43889细胞培养液各800ml， 4℃下离心15min，用Tris-HCL缓冲液（pH=7.5）洗涤两次。沉淀重悬在10ml上述溶液中，加入30ml甲醇和15ml氯仿，连续震荡30min。然后加入15ml氯仿和15ml Tris-HCL缓冲液（pH=7.5）,连续震荡2h。静置，溶液分层，弃去上层，保留下层，挥发溶剂。【10】用超声波按1mg/10μL的比率将样品分散在Tris-HCL缓冲液（pH=7.5）中。取10μL样品加入差式扫描量热仪的样品盘中，压盘后- 20 ℃处理30min，而后转入到 PerkinElmer DifferentialScanning Calorimeter (DSC 8000) 中。分析采用 10 ℃/min 的温度梯度在- 10～60 ℃ 的范围内进行,以空白作为对照。【11】
5. 参考文献
【1】GUPTA S K, SUANTIO A, GRAY A, et al. Factors associated with E. colicontamination of household drinking water among tsunami and earthquakesurvivors, Indonesia [J]. American Journal of Tropical Medicine amp; Hygiene,2007, 76(6): 1158-1162. DOI:10.4269/ajtmh.2007.76.1158.
【2】 KEBEDE B T, GRAUWET T, MUTSOKOTI L, et al. Comparing the impact ofhigh pressure high temperature and thermal sterilization on the volatile fingerprintof onion, potato, pumpkin and red beet [J]. Communications in Agricultural andApplied Biological Sciences, 2014, 56(2): 218-225. DOI:10.1016/j.foodres.2013.12.034.
【3】 王洲. 大肠杆菌脂多糖分子的核心多糖结构变化对细胞膜及胞内代谢的影响[D].江南大学,2016.
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