1. 研究目的与意义
microRNA（miRNA）是一类由19-24个核苷酸组成，在进化上高度保守的非编码小RNA，它们通常通过将其种子区域与靶mRNA相结合来介导基因的表达，在转录后水平对基因表达起到重要的调节作用[1]。miRNA在细胞增生分化与凋亡、免疫调节、肿瘤发生、胚胎发育和生物标记物等领域发挥着广泛的生物学作用，通过调控人体内miRNA的表达水平进而达到营养状况检测、疾病防控及治疗等目的[2]。具体来说，将miRNA的表达水平作为营养指标的生物标记物，或利用营养元素诱导特异性miRNA表达用于疾病防治，这些研究方向都可能具有潜在的巨大开发和利用价值。相对传统的肿瘤研究的分子如基因、mRNA、蛋白等，microRNA作为一种新奇的研究热点，具备了更多成为肿瘤标记物及治疗靶标的素质[3]。最近研究发现植物miRNA具有跨物种调节的可能性，能够通过肠道进入哺乳动物血液，进而转运到靶器官沉默相关基因的表达，这一发现让人们意识到了食物中miRNA的重要性，植物miRNA或许是一类一直以来被忽视的新型营养素。
植物miRNA跨领域调控的发现不禁让人们将目光聚焦到大豆上。众所周知，大豆一直以来被视为一种具有抗癌作用的功能性食品，经常食用大豆有利于预防癌症的发生，如乳腺癌、肺癌、结肠癌等等[4]。大豆miRNA的特殊作用机制使其有潜在的可能性作为一种新型营养素来调控癌症的发生。根据目前的研究与发现，本实验意在确定大豆中miRNA对结肠癌细胞株（CACO2）增殖、凋亡等方面的影响，通过进一步的分子生物学研究，探讨相关大豆miRNA对结肠癌细胞的作用机制。
2. 研究内容和预期目标
研究内容：
（1）通过通用植物microRNA提取试剂盒（Bioteke）提取大豆种子中lt;100nt 的大豆sRNAs（主要富集大豆microRNA），并对提取的sRNAs进行验证。
（2）将提取的大豆sRNAs转染至CACO2细胞中，以合成的乱序miRNA为对照，测定大豆sRNAs对结肠癌细胞增殖、迁移等指标的影响。
3. 国内外研究现状
自首个miRNA于1993年首次被发现后，人们开始大量着手于miRNA的研究，目前已表明这种仅有19-24个核苷酸组成的单链小RNA在转录后水平起到特异性的调控作用，其在在细胞增生分化与凋亡、免疫调节、肿瘤发生、胚胎发育和生物标记物等领域发挥着广泛的生物学作用。研究发现超过60％的人类蛋白质编码基因受到miRNA调节[5]，因此miRNA对于人体的生理调控作用具有重要的意义。研究证明营养元素可以调控动物机体内源miRNA的转录水平，而且能够调控miRNA转录活性的营养物质也不断被发现，包括氨基酸、葡萄糖、脂肪酸、植物素、维生素和矿物质等[6]，然而miRNA不仅仅只有内源合成，食物中同样富含有miRNA，同时研究证明膳食miRNA可以通过某种形式，如微泡等类似转运体进入到人体内并作用到靶器官进而起到基因调控的作用。一项研究表明，人类似乎以显着的量吸收牛奶中的miRNA，并且这些miRNA在人类白细胞，肾细胞和小鼠肝脏中表现出有效的基因表达[7]。这表明，牛奶中的miRNA可能是调节人体内基因表达和信号传导的生物活性物。有趣的是，研究还显示内源性miRNA的合成并不能弥补因喂食缺乏而导致的小鼠中的乳衍生的miRNA的含量[8]。
目前，植物miRNA的跨物种研究不断开展。研究发现在中国健康人体的血清中存在大约30种已知的植物miRNA，其中MIR156a和MIR168a显示相当程度的表达[8]。同时，另一项研究表明在西瓜汁和混合水果中评估了植物miRNA的可吸收性，在饮用果汁后，从志愿者的人血浆中选择16种miRNA进行测定，其中10个miRNA以高基础水平存在，6个在血浆中呈现动态生理模式[9]。到目前为止，人们已经发现多个植物miRNA可以有效地靶向人体中相关的基因进而调控相关蛋白的表达水平，如miR168a可以抑制LDLRAP1蛋白的表达从而减缓小鼠血浆中的LDL的去除[10]；miR156a被发现可以通过调控JAM-A蛋白进而抑制鼻咽癌细胞株上皮间充质转化。同时，研究还发现金银花中的miR2911可以通过饮食递送抑制小鼠内流感A病毒的复制进而起到缓解流感病情的作用，这种现象的发生表明miRNA可能是中草药中重要的，潜在有效的但以前未被认识的组分[11]。另一方面，最近表明mi159能够抑制乳腺癌的发生，为跨物种调控提供了证据。大豆中有丰富的植物miRNA资源，如上述所提到的miR156、miR168、miR159等等，同时根据生物信息学分析以及相关的研究发现，大豆miRNA在人体中具有潜在的多个靶标，大豆miRNA有极大的潜在性可以发挥内源miRNA对于细胞增殖方面的调控作用，因此以大豆为原料基础，研究大豆miRNA对于不同细胞株的影响具有理论上的可行性。
目前越来越多的证据证实了这种机制的可能性，但是该领域的研究仍处于初级阶段，仍然面临着靶标预测、递送及吸收规律以及调控机制等众多方面的问题与考验。不过随着更加广泛与深入的研究，种种难题也将迎刃而解，植物miRNA将可能成为防控或治疗人类疾病的新一代营养素，人类健康及疾病的研究或将跨入新时代。
4. 计划与进度安排
2022年1月03日-2022年1月19日：开题报告，确定实验题目，查阅相关文献，进行实验准备。
2022年2月25日-2022年3月05日：确定大豆sRNAs对CaCO2细胞的影响的研究方案，以及熟悉方案中所涉及的仪器的使用。
5. 参考文献
[1] Lee R C, Feinbaum R L, Ambros V. The C. elegansheterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity tolin-14.[J]. Cell, 1993, 75(5):843.
[2] Lagosquintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs.[J]. Science,2001, 294(5543):853-858.
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