1. 研究目的与意义
由于DON的广泛存在,世界上大部分地区的农作物都检出含有该毒素,大大降低了谷物的活力以及农产品的营养价值,造成严重的经济损失;人畜食用了污染的粮食会造成严重的危害,因此对于DON的去除是现阶段迫切需要解决的核心问题。基于食品安全“从农田到餐桌”的监管体系,除了从源头防控DON,对已经污染了DON的粮食进行脱毒化处理也亟待妥善解决。本文拟通过臭氧处理技术将DON降低到安全范围内,降低其潜在的风险,服务于粮食安全。 臭氧能够有效的降解粮食中的DON毒素,但不同程度的臭氧处理对粮食中DON毒素的降解效果也不尽相同。故本课题主要以受DON毒素污染的小麦为研究对象,通过分析臭氧处理时间、臭氧浓度及小麦水分含量这三个处理因素对小麦中的DON毒素进行降解处理,研究出最佳的臭氧处理方法来降解小麦中的DON毒素,为将来应用于大型仓库提供方法。
2. 研究内容和预期目标
1. 研究臭氧处理时间对小麦中DON的降解效果
2. 研究臭氧浓度对小麦中DON的降解效果
3. 研究小麦水分含量对小麦中DON的降解效果
3. 国内外研究现状
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,缩写DON)又名呕吐毒素(Vomitoxin),是单端孢霉烯族毒素的一种,是一种全球性的粮谷类食品污染物,在食品安全学中被认为是严重的生物性危害之一。虽然DON毒性较同族其它真菌毒素小,但因其对谷物的污染率和污染水平居镰刀菌毒素之首,同时常与其他真菌毒素共存协同作用致病,不仅对小麦细胞、组织等本身具有抑制或毒害作用,还会污染食品和饲料,更严重的是人和动物食入被DON污染的食品后,对人类、动物健康造成了严重危害。近年来的研究还发现,DON可能与人类和动物贫血、食管癌、克山病和大骨节病、IgA肾病等免疫系统疾病有关。因此,DON受到预防医学、食品卫生学、作物育种、病理学、兽医界和各国政府的高度重视。此外,DON还具有很强的细胞毒性和胚胎毒性,已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一,列入国际研究的优先地位。但由于经济社会发展状况的原因,我国目前对DON的卫生监督工作无论立法还是执法的水平还与国外先进国家存在一定的差距。由于DON的毒性及危害,世界上已有 37个国家制定了DON的限量标准,食品中DON的限量标准从0μg/kg(婴儿食品)到2000 μg/kg 不等。2011年,我国颁布了新修订的真菌毒素限量标准,规定谷物及其制品中DON含量不超过 1000 μg/kg。
对谷物和饲料进行适当的脱毒处理是控制和减轻霉菌毒素危害的重要方法,研究者们已做了很多关于DON脱毒的研究,基本上分为物理、化学和生物脱毒3 类。物理法主要采用漂洗研磨、热处理、辐射处理及添加霉菌毒素吸附剂等手段来减少粮食和饲料在贮藏期的DON含量;化学法多采用一些强酸、强碱等化学试剂处理及臭氧氧化等方法来达到降低DON含量的目的。Mishra等研究表明热处理可破坏DON结构中的环氧基团,生成毒性较低的降解产物DOM-1。在125~250 ℃条件下,水溶液中16%~100%的DON被降解,且温度升高有助于DON降解生成DOM-1。随后,Vidal等在研究小麦烘焙过程中DON的降解动力学时证实了这一观点。臭氧对DON具有明显的降解效果。用10 mg/L的臭氧气体处理1μg/mL的DON溶液30s后,DON降解率达到93.6%。臭氧可使小麦颗粒表面和胚乳上的DON完全降解,不仅对小麦面粉质量没有影响,还可延长小麦粉保质期。
臭氧是一种强氧化剂,可迅速破坏有机物中的双键;且臭氧具有良好的渗透性,能够快速分解为氧气,不产生任何有毒残留;获取方便,无需存储和后续处理,极具应用潜力而受到世界上许多国家的学者所认同。1986年,Yoμng 等利用包括臭氧在内的物理和化学方法处理小麦和玉米中的DON,发现臭氧对小麦中DON具有良好的降解效果,且具有一定湿度的臭氧降解DON效果的比干臭氧更好。2006年,Yoμng 等又在研究不同浓度的臭氧水对10种单端孢霉菌毒素的降解效果基础上,对含DON在内的10种毒素的降解产物生成途径做了简单推测,结果均表明,臭氧对包括DON在内的诸多真菌毒素具有良好的降解效果。
4. 计划与进度安排
溶剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为符合 GB/T6682规定的一级水。
1 甲醇:色谱纯。
2 乙腈:色谱纯。
3 聚乙二醇 (相对分子质量8000)。
4 PBS清洗缓冲液:称取8.0g氯化钠 、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用990m L水将上述试剂溶解,然后用浓盐酸调节pH至7.0,再用水稀释至1L。
5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品:质量浓度100.7μg/mL,不确定度3.2μg/mL。
6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液:根据使用需要,准确吸取一定量的脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准储各 液 ,用流动相稀释 ,分别配成相当于0.1μg/mL、0.2μg/mL、 0.5μg/mL、 1.0μg/mL、 2.0μg/mL、5.0μg/mL的标准工作液 ,4℃ 保存,可使用7d。
7 呕吐毒素-免疫亲和柱:3mL。
8玻璃纤维滤纸::直径110mm,孔径1.5μm。
仪器和设备
1 电子天平:感量0.01g。
2 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。
3 高速离心机。
4 高速万能粉碎机:转速100r/min。
5 玻璃注射器:10mL。
6 超声波清洗器。
7 空气压力泵。
分析步骤
1 试样制备与提取:
将样品研磨,硬质的粮食等用高速万能粉碎机磨细,不要磨成粉末。称取2.5g(精确到0.01g)磨碎的试样于10mL容量瓶中加人0.5g聚乙二醇),用水定容至刻度,混匀,转移至离心管中,超声30min,离心机转速2500r/min,离心10min。定量滤纸过滤后,以玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,收集滤液A于干净的容器中。
1.1 正交试验设计:
按正交表设计试验方案进行正交试验。确定影响小麦中 DON 的降解效果的优化参数。
| 臭氧浓度A /ppm | 臭氧处理时间B/min | 小麦水分含量C/% |
1 | 25 | 20 | 10 |
2 | 50 | 40 | 12.5 |
3 | 75 | 60 | 15 |
4 | 100 | 80 | 17.5 |
2 净化:
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取l中滤液A或 B或C 2.0m L,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进人亲和柱中。用5m L PBS清洗缓冲液和5m I水先后淋洗免疫亲和柱,流速约为1滴/s~2滴/s,直至空气进人亲和柱中,弃去全部流出液,抽干小柱。
3 洗脱:
准确加人1.0m L甲醇洗脱,流速约为1滴/s,收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中,HPLC测定。
4 高效液相色谱参考条件:
a) 色谱柱:C18柱,5μm,150mm4.6mm或相当者;
b) 流动相:甲醇 水 (20 80);
c) 流速:0.8m L/min;
d) 柱温:35℃ ;
e) 进样量:50μL;
f) 检测波长:218nm。
5 定量测定:
以脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液浓度为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对试样进行定量,标准工作溶液和试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的响应值均应在仪器检测线性范围内。
6 空白试验:
除不加试样外,空白试验应与测定平行进行,并采用相同的分析步骤。
7 平行试验:
按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定。
8 结果计算:
试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量按式 (1)计算 :
式 中:
X一 试样中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量,单位为毫克每千克 (mg/kg);
cl一 试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度,单位为微克每毫升 (μg/m L);
c0一 空白试样溶液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的浓度,单位为微克每毫升 (μg/m L);
V 一 甲醇洗脱液体积,单位为毫升 (m L);
m一 试样的质量,单位为克 (g);
f 一 稀释倍数。5. 参考文献
[1]刘坚,毛红霞.小麦籽粒中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测及分布研究[J]. 粮食科技与经济,2018,43(06):83-86.
[2]杨龙. 臭氧水协同超声波处理对小麦中呕吐毒素的降解效果研究[D]. 河南工业大学,2018.
[3]王莉,罗颖鹏,罗小虎,王韧,李永富,李亚男,邵慧丽,陈正行. 臭氧降解污染小麦中呕吐毒素的效果及降解产物推测[J]. 食品科学,2016,37(18):164-170.
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