1. 研究目的与意义
一、主要内容
1.掌握G蛋白偶联受体蛋白常用的分离、纯化、结晶等方法；
2.在获得CCR5与X蛋白复合物的基础上，设计优化分离纯化方案，着重筛选去污剂种类和浓度以及盐浓度等影响因素，研究其对蛋白复合物样品稳定性的作用；
2. 文献综述
去污剂在膜蛋白研究中的应用
王德健
摘 要 膜蛋白(Membrane Proteins) 主要定位在生物膜的表面，在各种重要的生理活动中发挥着重要作用，覆盖基因调控、信号转导和能量代谢等各个层面。作为细胞中一类重要的蛋白质分子，其基因数目约占整个基因组编码基因的30%，但已知的膜蛋白结构数目却只占整个蛋白质结构数据库的1.1%左右[1]。近年来，随着新型去污剂的不断涌现以及膜蛋白表达、纯化、结晶及衍射技术的不断完善，膜蛋白结构解析日益成为结构生物学领域的研究热点。本文就去污剂在膜蛋白的分离、纯化和结晶中的应用作简要概述。
3. 设计方案和技术路线
一、研究方案
1.在实验室已有基础上设计初步分离纯化方案进行小量纯化实验，针对实验结果优化纯化步骤（去污剂种类、浓度、盐浓度等影响因素）；
2.将优化后的纯化步骤应用于大量实验，并对纯化蛋白进行结晶实验；
4. 工作计划
1.第1-2周：熟悉并掌握生化实验常规操作和技术如分子克隆技术、目的基因表达和蛋白纯化、Nu-PAGE、HPLC-SEC、CPM-assay等；
2.第3周-至今：熟悉并掌握CCR5-X复合物的纯化技术，筛选去污剂种类和浓度及盐浓度；
5. 难点与创新点
本课题拟采用LCP（lipid cubic phrase，脂立方相）的方法对获得的CCR5受体与相应蛋白配体复合物进行结晶实验，通过对蛋白晶体或者微晶进行X射线衍射实验最终得到其三维结构。在复合物样品的制备过程中，主要的创新点在于：
（1）创建共表达体系，拟在共表达过程中蛋白配体与受体相互作用达到稳定受体的目的并纯化出稳定的复合物组分；
（2）在共表达体系中，根据已有的功能实验设计相互作用位点间半胱氨酸突变组合，拟在蛋白配体与受体相互作用的同时形成稳定的共价二硫键交联辅助复合物的稳定性。
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