1. 研究目的与意义
毕业设计的内容：
在前期文献调研的基础上，对中药野马追中丰量倍半萜内酯活性成分A和B进行结构修饰和抗炎构效关系研究。
毕业设计的意义：
2. 文献综述
野马追倍半萜内酯的分离鉴定及抗炎活性评价
吉佳明
摘 要：野马追是一种止咳平喘效果显著的天然药物，从中分离纯化得到的野马追内酯具有抗人体鼻咽癌细胞的功效，并且具有抗炎功效。目前对野马追的药理研究，开发利用还不成熟。本文通过对野马追药材的质量标准进行研究考察，并在此基础上，确定了野马追内酯的分离纯化工艺，并通过细胞研究对其抗炎活性做出研究评价。
关键词：野马追；野马追内酯A；野马追内酯B
ABSTRACT
Eupatorium lindleyannumDC.is a natural herb with significant antitussive and antiasthmatic effects. Eupatorium lindleyannumlactone has the effect of anti-nasopharyngeal carcinoma cells and has anti-inflammatory effect. At present, pharmacological studies on Eupatorium lindleyannumhave been carried out. In this paper, the quality standard of Radix et Rhizoma Mustanae was studied, and on the basis of this, the separation and purification process of the wild angustifolide was determined, and its anti-inflammatory activity was evaluated by cell study.
KEY WORDS Eupatorium lindleyannum，eupalinolide A，eupalinolideB
文献综述
野马追，又名白鼓钉，化食草，毛泽兰，分别出自《江苏南部种子植物手册》、《杭州药用植物志》和《内蒙古植物志》，是多年生草本植物菊科轮叶泽兰的地上干燥部分。药材资源丰富，分布较广，除新疆外中国各地均有分布，盛产于江苏、安徽等地区，常见于湿地、溪边或湿润的山坡。味苦，性平，归肝、脾经，具有清热解毒、化痰止咳、利尿消肿、降血压等多种功效。临床上常用于慢性气管炎、气管炎、高血压等病症的治疗[1]。
野马追地上部分含有多种类型的化学成分，比如挥发油、黄酮类、生物碱、香豆素、倍半萜内酯类等。其乙醚与乙醇粗提部分当作用于离体回肠时有非常明显的抗组胺作用；10%浓度的煎液对流感杆菌、金黄色葡萄球菌、甲型链球菌及其他球菌均有抑制作用；其黄酮类化合物能增加白细胞数；生物碱对豚鼠离体回肠有显著的松弛作用，还具有降压功效；其总黄酮和总生物碱均具有镇咳作用。迄今为止，已经上市并用于临床的野马追剂型有糖浆剂、片剂、颗粒剂，还有以野马追为君药的复方野马追胶囊、颗粒产品，主要是用于呼吸系统疾病和高血压疾病的治疗，其他疾病方面的治疗相对较少。
为了更好地、有效地利用并保护野马追药材资源，对野马追进行深度的研究是非常有必要的。通过对其深入的研究，我们可以在日渐匮乏的自然资源条件下，最大程度地开发利用野马追资源，从而带动社会经济，促进可持续发展，造福人类。野马追已经引起国内外学者的极大关注，对野马追药材的化学成分、药理作用和临床应用等方面进行一系列的研究，并取得了一定的研究成果。现结合国内外文献，将野马追药材的研究概况综述如下：
、野马追的形态学研究
野马追多年生草本植物，高30-150cm。地下部分根茎短，根茎周围丛生须状根，支根比较纤细，颜色淡黄白色；地上部分茎直立，呈圆柱型，粗糙有纵棱，茎上部分枝表面呈淡褐色或淡紫色，散生紫色斑点，表面被灰白色毛茸，嫩时较浓密，老时较稀疏；叶对生，无柄或几乎无柄。叶片条状披针形，长5~12cm，宽1~2cm，3裂或不裂，叶片边缘有疏锯齿，两面均有白色柔毛，有些叶片下面或仅沿叶脉有细柔毛，叶片下面有黄色腺点，基出3脉，脉在下面隆起；头状花序顶生，排列成伞状；总苞呈钟状，总苞片9，淡绿色或淡紫色，先端急尖；头状花序含个筒状两性花；瘦果长有腺点，无毛；花果期5~12月。气微，叶味苦、涩[2]。
野马追是江苏省地产中药材，在江苏省野马追种植基地发现有多种生长类型存在，根据生长年限可分为一年生、二年生、三年生这三种类型；根据花的颜色可分为紫花、白花两种类型；根据叶片的宽度可分为窄叶、宽叶两种类型；根据这几种性状的组合，实地考察发现，一年生野马追有六种生长类型，二年生、三年生野马追均有四种生长类型[3]。如下表所示：
表1-1野马追的不同生长类型
一年生二年生 三年生 |
紫花青茎多毛窄叶紫花青茎多毛窄叶紫花青茎多毛窄叶 紫花青茎疏毛窄叶紫花青茎疏毛宽叶紫花青茎疏毛窄叶 紫花紫茎疏毛窄叶紫花紫茎疏毛窄叶紫花紫茎疏毛窄叶 白花青茎疏毛窄叶白花青茎疏毛窄叶白花青茎疏毛窄叶 紫花青茎疏毛窄叶 紫花紫茎多毛窄叶 |
二、野马追的生态学研究
野马追是菊科轮叶泽兰（Eupatorium lindleyannum）地上干燥部分，喜欢温暖湿润气候，充足的阳光，耐寒，不怕水涝，喜欢土壤肥沃的地方。在6、7月份高温雨水季节生长旺盛，药源丰富，常生于湿润山坡、草地或溪旁，全国各地除新疆外均有分布，盛产地为江苏盱胎。现代栽培野马追的方法主要靠根茎或种子繁殖，实际生产上常以根茎繁殖为主。野马追常在秋季釆收，晒干剪茎即可做药材用。
由于总黄酮是野马追制剂中的有效控制成分[4]，所以经常用总黄酮含量来作为评价野马追药材质量的一个重要指标。野马追中总黄酮的含量在其生长过程中是不断变化的。胡林水[5]通过研究发现其黄酮含量在生长各阶段有一定的规律，结果表明，总黄酮含量在野马追顶花初开时最高，最佳采摘时间应在顶花将开前2~3天。钱士辉[3]等以槲皮黄素、山奈甲黄素、棕矢车菊素和总黄酮苷元为质量指标，采用HPLC法对各种生长年限类型的野马追进行了初步的质量评价，结果表明，总黄酮苷元在一年生野马追中含量较低，在二年生、三年生野马追中含量较髙，此研究结果为野马追优良品种的选择和培育提供了科学依据。目前，由于自然资源日益减少，市场对于野马追药材的需求主要靠人工栽培来满足，张旭东等[6]通过研究发现野马追主要产地的生长环境因子和其生物量之间的有一定的相关性，从而得出结论：野马追在微酸环境的土壤中比较适宜生长，当PH为6.0左右时，生长指数最佳；不适合间种，与其他作物间种会明显降低其生物量的含量；土壤中碱解氮含量和速效钾含量的高低也会影响其生物量的增加。
三、野马追的化学成分研究
关于野马追化学成分和药理作用的研究资料很少，文献中记载其地上部分含有挥发油0.024%，茎叶0.025%，花为0.078%。此外，还含有黄酮、生物碱、香豆精及萜类等成分，但大都未对其进行深入研究[7]。
迄今为止，从野马追药材中发现的化学成分类型主要有黄酮类、生物碱类、三萜类、倍半萜类、微量元素等，其中以研究倍半萜类成分的较多。现结合国内外文献将野马追的化学成分概述如下：
3.1 倍半萜内酯类
倍半萜类化合物有很多是具有非常重要的生理功能和生理活性的，特别是倍半萜内酯，已被证明有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、细胞毒等活性。鄢贵龙[8]等采用高速逆流色谱（HSCCC）从野马追的乙酸乙酯萃取部分分离纯化得到3种倍半萜稀内酯:3β-Hydroxy-8β-[4，-Hydroxytigloyloxy]-costunolide（1）、野马追内酯A（2）和野马追内酯B（3）；杨念云[9]等通过采用多种柱层析法，从野马追的地上全草中分离得到两种新的吉马烷型倍半萜内酯：野马追内酯A（2）和野马追内酯B（3）。结构见图1-2：
3.2 黄酮类
野马追药材中富含黄酮类成分，许多黄酮类成分具有止咳、怯痰、平喘、抗炎镇痛等功效。钱士辉[8]等采用桂胶色谱法从野马追的乙酸乙酯萃取部位中分离得到了六种黄酮类化合物，经结构鉴定为金丝桃苷（hypersoide）、三叶豆苷（trifolin）、黄芪苷（astragalin）、槲皮素（quceritin）、山奈酚（kaempferol）、棕矢车菊素（jaceosedin)；杨念云[10]等应用多种柱层析法从野马追地上全草中得到芦丁（rutin）和其他类型的化合物。结构如下表所示：
3.3 二萜类
二萜类化合物广泛分布于植物界，许多二萜类的含氧衍生物具有多方面的生物活性。Wu[11]等采用硅胶柱层析法对野马追的氯仿萃取部位进行研究，分离纯化得到了新的三种五环二萜化合物，运用现代波谱学手段（UV、IR、13C-NMR、1H-NMR、2D-NMR）和理化性质，经鉴定确定为3-（Hydroxymethyl）-1,14,15-trihydroxy-7,11,15-trimethy1-2,6,10-hexadecatrien-13-ylacetate（1）、3-（Hydroxymethyl）-1,13,15-trihydroxy-7,11,15-trimethy1-2,6,10-hexadecatrien-14-ylacetate（2）、3-（Hydroxymethyl）-1,13,14,15-trihydroxy-7,11,15-trimethy1-2,6,10-hexadecatriene（3）结构如下表1-4所示：
3.4 三萜类
杨念云[10][12]等采用硅胶柱层析和重结晶等方法，从野马追地上全草部分得到3个五环三萜类化合物，经物理化学和光谱法鉴定为：伪蒲公英甾醇（ψ-taraxasterol）、蒲公英甾醇乙酸酯（taraxasterol-acetate）和蒲公英甾醇棕榈酸酯（taraxasterol-palmitate）。
3.5 甾醇类和有机酸类
杨念云[10][12]从野马追的地上全草部分中分离得到β-谷甾醇（β-sitosterol）和胡萝卜苷（daucosterol）两种甾醇类化合物，同时还有正十六烷酸和咖啡酸两种有机酸。崔伟伟[13]采用高效液相色谱法测定野马追药材中不同提取方法所得到的绿原酸含量，从而得出结论：超声波提取法提取效率最好。
3.6 微量元素
微量元素与中药的功效有一定的关系，微量元素与有机成分结合后会产生新的化合物或者配位化合物，产生协同作用，提高疗效[14]。微量元素虽然在人的机体内只占质量的万分之一以下，但它们在抗病、防癌、延年益寿等方面起着不可忽视的作用，在整个生命活动中起着非常重要的作用。王晔[15]等采用微量元素分析仪测定了野马追根、茎、叶、花中所含的微量元素的种类和含量，研究结果表明，野马追中主要以铁（Fe）、铝（Al）、硅（Si）元素为主，其次为锶（Sr）、铊（Ti）、锰（Mn）、钡（Ba），再次为锌（Zn）、硼（B）、铅（Pb）、钒（F）、铜（Cu）。陈健[16]用干法处理野马追样品，采用电感耦合等离子体原子发射光谱IPU-AES法进行微量元素的分析，结果表明，野马追中含有人体必需的7种微量元素和很少量的有害重金属（铅、锶、镉）。
3.7 其他类成分
此外，野马追还含有丰富的挥发油成分和氨基酸成分。肖晶[17]等釆用气相色谱-质谱联用（GS-MS）法对野马追的地上全草部分进行分离分析鉴定，得到41种挥发油成分，主要分为棕榈酸、β-蒎烯、石竹稀内酯。杨念云[12]等采用多种柱层析法对野马追的地上全草部分进行了研究，分离得到了正十六烷酸和腺苷。陈健[18]采用柱前衍生化法（RP-HPLC）测定了野马追药材茎叶及其花蕾中的游离氨基酸和总氨基酸。结果表明，野马追茎叶及其花蕾中半胱氨酸（cys）和谷氨酸（glu）所占的含量较高，分离得到的十七种氨基酸中有七种是人体必需氨基酸。
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3. 设计方案和技术路线
分离提纯野马追倍半萜内酯成分A和B，开展A和B的结构修饰和体内外抗炎构效关系研究。
1.跟随指导老师完成A和B的部分结构修饰工作；
2.完成野马追及其结构修饰产物对脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞释放NO抑制实验。
4. 工作计划
实验进度：
2018.1~2：查阅文献，设计实验方案；
2022.2~5：进行实验；
5. 难点与创新点
首次开展野马追倍半萜内酯成分A和B及其结构修饰产物的体外抗炎活性评价，并研究其抗构炎效关系研究，探讨可能的抗炎活性基团。
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