1. 研究目的与意义
茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.) DC.，为菊科多年生草本植物，临床应用广泛。近年来由于过度采挖、生境破坏及其自身生物学特性，道地茅苍术已成为濒危物种，逆境胁迫已成为影响其品质形成的重要限制因子。
茅苍术的主要成分为挥发油，倍半萜类化合物是其中主要的活性成分，这类成分通过MVA代谢途径中一系列的酶来合成，其中HMGR是 MVA 途径中的第一个限速酶，FPPS则是其下游分支点生物合成的关键酶。在品质形成及胁迫对其造成影响的研究中，qRT-PCR分析相关基因表达研究尤为重要，而茅苍术内参基因筛选及基因表达分析相关研究鲜见报道。
本课题旨在筛选出用于分析干旱胁迫条件下茅苍术不同组织中稳定表达的理想内参基因，并研究茅苍术开花初期倍半萜类活性成分生物合成关键酶HMGR、FPPS基因的差异表达。研究结果为茅苍术活性成分生物合成关键酶基因表达分析奠定基础，也为进一步进行干旱等逆境条件下茅苍术品质评价研究提供参考。
2. 文献综述
濒危药用植物茅苍术研究综述
摘要：本文对茅苍术的质量评价、化学成分、qRT-PCR技术、常用内参基因、倍半萜类活性成分生物合成关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A , HMGR）、法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase , FPPS）等方面进行综述。
关键词：茅苍术；品质资源；qRT-PCR；HMGR；FPPS
茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.) DC.为菊科术属多年生草本植物，其根茎与北苍术A. chinesis (DC.) Koidz.的根茎共同作苍术入药[1]，性辛、苦、温，、归脾、胃、肝经。临床用于湿阻中焦[1-2]，脘腹胀满，泄泻，水肿，脚气痿躄，风湿痹痛，风寒感冒，夜盲，眼目昏涩等症，中医临床应用历史悠久，用途较为广泛。
1. 种质资源研究
随着中药产业的快速发展，苍术资源的需求加大和过度采挖，野生苍术资源越来越少。近些年来，优质苍术的市场价格连年攀升，为缓解苍术资源紧缺现状，尤其是为了保护苍术道地药材，不少地方纷纷开始引种栽培，但是由于生态环境的影响，使引种栽培的苍术药材性状变异太大，无法解决商品药材苍术的来源问题，同时苍术栽培种植中病虫害严重，随着栽培年限的增加，植株发病率和死亡率均升高，而且苍术的栽培还存在着明显的连作障碍，这些都严重影响了苍术的栽培种植。
土壤养分失衡，土壤微生物群落结构改变，植物毒素物质增加及土壤物理化学性质改变等是引起苍术连作障碍的主要原因[3～6]。对人参栽培连作障碍的研究表明，土壤病害占35%，线虫占16%，营养缺乏占12%，土壤酸化占7%，土壤物理性状变坏占5%，盐份积累占5%，其他占3%，不明原因占18%[9]。有些作物的连作障碍，可通过特殊的栽培调控措施得到解决，但有的至今仍未得到彻底解决，如当归、人参、附子和地黄等[7～11]。由此可见，药用植物土壤环境的恶化通常表现为土壤环境的全面改变，对其治理思路应采取多种调控手段的综合治理。
茅苍术喜温暖凉爽、阳光充足的气候，耐寒，耐旱，忌积水，其适生地为丘陵山区半阴半阳的荒坡地，露地栽培应与玉米套种，以荫蔽度在30%左右较适宜[12]。通过对一年生栽培及野生茅苍术的原植物形态、药材性状、粉末特征、组织特征、化学成分等方面的比较进行研究，结果表明一年生栽培茅苍术与野生品的质量基本一致，为推广应用人工栽培茅苍术提供了依据[13]。研究表明，苍术商品以植株枯萎后，采收的三年生苍术根茎为优[14]。杨秀珍等研究了江苏地区茅苍术的生长发育规律，介绍了茅苍术播种、移栽、肥水管理、病虫害防治和采收的人工栽培技术[15]。对茅苍术栽培品进行摘蕾、除蘖的试验表明，在同等环境下，摘蕾对增加茅苍术产量有显著效果，除蘖对茅苍术产量影响不大[16]。徐晓兰等分析茅苍术在原产地及引种栽培1年后5个主要挥发油成分的含量变化。研究结果表明，不同产地野生茅苍术挥发油的主要成分和含量明显不同，但在引种栽培至同一环境（江苏南京）后，茅苍术挥发油的主要成分及含量差异明显减小，表明生长环境对茅苍术挥发油有效成分的组成有一定的影响[17]。
针对茅苍术野生资源濒危的情况，巢建国等对茅苍术组织培养及快速繁殖的方法进行了初步研究，选出最佳分化培养基MS 6-BA 3.0 mg/L NAA 0.4mg/L、生根培养基1/2 MS NAA 0.3 mg/L，并大量培育了茅苍术试管苗[18]。刘海萍等在此基础上进一步探讨了以组织培养为手段进行茅苍术快速繁殖的途径。研究以叶柄、叶片为外植体，在MS培养基上添加不同的激素配比以进行培养，为茅苍术资源的保护和可持续利用提供了有效途径[19]。袁媛等进行了利用组织培养技术快速获得苍术的不定根的研究，为进一步大规模生产其有效成分和研究苍术有效成分的代谢途径打下了基础[20]。李西腾等研究了茅苍术根茎侧芽的组织培养方法，选出最佳芽诱导培养基MS 6-BA2mg/L NAA0.4mg/L；在继代培养中，仍以MS为基本培养基，不同阶段使用不同的激素组合，前期所用浓度相对高些，随着继代代数的增加，激素浓度应降低；在生根培养中，以1/2MS NAA0.5mg/L效果好。在茅苍术的组培快繁研究中，以根茎侧芽作为外植体，从芽诱导、芽增殖，到诱导生根的培养，已建立起比较完整的体系，为茅苍术进行规模化生产，大批提供种苗打下了技术基础[21]。赵玉国等选出了茅苍术种胚最佳分化培养基 MS 6-BA 1.0mg/L NAA 0.2mg/L，不定芽最佳分化培养基MS 6-BA 2.0mg/L NAA 0.2mg/L和增殖芽最佳生根培养基1/2 MS NAA 0.5mg/L[22]。陶燕等采用GC-MS联用技术对组培茅苍术和野生茅苍术的根茎中所含挥发油的化学成分进行比较，研究结果表明组培茅苍术的根茎中所含的β-桉叶醇、苍术醇、苍术素的含量高于野生品，但是两者的挥发油所含成分没有显著性差异[23]。袁媛等采用GC内标法测定了苍术组培苗及愈伤组织挥发油中β-桉叶醇的含量，建立苍术β-桉叶醇的含量测定方法[24]。
陶金华等采用正交试验法研究了不同的植物生长调节剂对茅苍术叶柄、叶片和根茎愈伤组织诱导的影响，研究结果表明，不同外植体在各自的最佳培养条件下，以叶柄的培养效果最好，其中2,4-D对茅苍术愈伤组织的诱导具有极显著的效果，而诱导叶柄愈伤组织形成的最佳组合为0.4mg/L NAA、0.4mg/L KT和4.0mg/L 2,4-D，培养20d左右，诱导率达到99%。此外，茅苍术叶柄细胞悬浮培养至18d时，其细胞量、多糖和苍术素的含量均达到最大值，分别为9.07g/L、15.68 g/L和19.62g/L[25]。
此外，茅苍术具有很好的抑制土壤霉菌的作用，在花生花针期，同时栽种茅苍术可使土壤中霉菌含量减少53.87%。花生收获后，土壤中霉菌数量增加，有利于物质循环和养分还田。茅苍术和花生套种可以有效调节土壤微生物区系[26]。
2.化学成分研究
2.1 挥发油类
茅苍术根茎中含有挥发油3.25~6.92%，主要成分为苍术素和苍术醇（茅术醇和β-桉叶油醇的混合物）[27,28]，还有β-石竹烯、α-榄香烯、α-蒎烯，香桧烯，榄香醇，β-蒎烯，香叶烯，α-水芹烯，β-水芹烯，δ-3-蒈烯，β-芹子烯，对-聚伞花素，α-姜毕烯，柠檬烯，β-顺-罗勒烯，β-反-罗勒烯，乙酸龙脑脂，δ-榄香烯，香茅醇乙酸酯，反-丁香烯，葎草烯，γ-毕澄茄烯，δ-毕澄茄烯，十氢-4ο-甲基-1-亚甲基-7-(1-甲基亚乙基)萘，丁香烯氧化物，茅术醇，β-桉叶油醇，苍术酮，苍术素异构体，苍术素等[29]。
β-桉叶醇 beta-eudesmol | 茅术醇 Hinesol | 苍术酮 Atractylone |
苍术素 Atractylodin | α-榄香烯 Alpha一elemene | β-石竹烯 Beta caryophyllene |
图1-1 茅苍术倍半萜类主要成分化学结构
Fig. 1-1 The structure of the main sesquiterpene in Atractylodes lancea (Thunb.) DC.
2.2 多糖类
徐秀泉等利用响应面分析法优化茅苍术多糖的提取工艺，结果表明，茅苍术多糖提取的最佳工艺条件为：提取温度87 ℃，料液比1∶22，提取时间3.1 h。在此最佳条件下，茅苍术多糖的提取率为2.12%[30]。
段国峰等对茅苍术多糖的提取，分离纯化和单糖的组成进行了分析研究，茅苍术经热水提取乙醇沉淀得多糖粗品(AWP)，AWP经脱蛋白、透析、DEAE-纤维素柱和Sephadex-100柱层析进行纯化，纯化多糖通过色谱等方法进行分析。结果粗多糖主要含APW1，APW2，APW3，APW4四个组分。纯化多糖经高效凝胶色谱、薄层层析、气相色谱等分析得四个组分的分子量，为茅苍术多糖的进一步研究提供了基础[31]。
而后段国峰等又对茅苍术多糖中单糖组成，各单糖、中性糖、糖醛酸、蛋白质的含量进行分析，粗多糖经分离纯化后，通过气相色谱、分光光度法等进行分析，粗多糖APW主要含4个组分：APW1～APW4，各组分均含阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等单糖，APW1～APW4的中性糖含量分别是：60.1 %、22.6 %、20.1 %、16.9 %，糖醛酸含量分别为：7.7 %、9.8 %、25.5 %、27.6 %[48]。
2.3 脂类
汪六英等将茅苍术的乙醇提取物所得的浸膏，通过溶剂萃取、硅胶柱色谱和重结晶等方法处理，分离得到14个化合物，鉴定出11个化合物，分别为伪蒲公英甾醇乙酸酯、蒲公英赛醇乙酸酯、β-桉叶醇、豆甾醇、β-谷甾醇、白术内酯Ⅳ、胡萝卜苷、葡萄糖、蔗糖，其中化合物豆甾醇、伪蒲公英甾醇乙酸酯、蒲公英赛醇乙酸酯为首次从该植物中分离得到[32]。
3.实时荧光定量PCR
实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)是在传统PCR技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术,具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。
3.1 qRT-PCR 技术在由真菌引起的植物病理病害上的应用
1999 年 BOHM 等首次将实时荧光定量 PCR 应用于植物病害中真菌的检测。2002年中国程颖慧等报道了小麦印度腥黑穗病的实时荧光定量PCR检测[33]。高强等[34]通过对小麦矮腥黑穗病菌(TCK)及其近似种小麦网腥黑穗病菌（TCT）和小麦光腥黑穗病菌（TFL）的rDNA序列ETS区域测序比较分析，找出TCK的特异性序列并设计了实时荧光PCR探针，从分子生物学上成功利用实时荧光定量PCR技术对TCK的检测，大大提高了对TCK检验检疫的准确性和效率。内生真菌是生活史全部或局部在寄主体内，而不表现明显病害症状的一类真菌[35]。苏丹等[36]选取内生真菌特异性引物，成功设计并建立了利用实时荧光定量PCR技术对黑麦草中内生真菌感染情况的检测和定量分析方法。据报道苇状羊内生真菌（Neotyphodium coenophialum）和多年生黑麦草内生真菌（Neotyphodium lolii）对美洲等国家的畜牧业曾经造成过巨大损失。黄国明[37]等设计了通用TaqMan探针及引物和特异TaqMan探针及共用引物，结合通用探针的单色荧光PCR和特异探针的双色荧光PCR两种方法，成功摸索出一种N.coenophialum和N.lolii的菌丝及单粒种子快速、稳定、可靠、特异性强的荧光PCR检测方法，使检测时间由至少一个月缩短至7~8 h，而且检测灵敏度达到单粒种子。
3.2 qRT-PCR在植物病原细菌病害上的应用
植物病原细菌（phytobacteria）能引起多种农作物、园林观赏、经济作物及牧草上的病害。利用荧光定量PCR 技术准确成功鉴定的有柑桔黄龙病[38-39]、番茄溃疡病菌[40-41]（Clavibacter michiganensis subsp.Michiganersis）、柑桔溃疡病[42]（Xanthomonas citri(hasse)Dowsom）、西瓜细菌性果斑病菌[43]（Acidovorax avenae subsp. citrulli，简称 A.a.c）、梨火疫病菌[44]（Erwinia amylovora）、玉米细菌性枯萎病菌[45]（Pantoea stewartii subsp. Stewartii，简称 PS）、苜蓿细菌性萎蔫病菌[46]（Clavibacter michiganensis subsp. Insidiosums）、菜豆细菌性萎蔫病 菌[47]（Curtobacterium flaccumfaciens pv.Flaccumfaciens）、香蕉枯萎细菌性病菌[48]（Ralstonia solanacearum race 2）、马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus）、青枯劳尔氏菌（Ralsto nia solanacar）、燕麦食酸菌（Acidovorax avena）、根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）木质部寄生难养菌（Xylella fastidiosa）、密执安棒形杆菌的不同亚种（Cl.michiganensis.sub-spp.）、梨 火 疫 病 菌 (E.amylovora)、稻 白 叶 枯 病 菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）、水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）等细菌的检测[46,49]。传统方法对植物病原细菌的检测主要是采用生物学和血清学方法，费时又费力。自从实时荧光定量PCR 技术应用于植物病原细菌的检测之后，不仅有效地提高了检测速度和水平，而且检测的灵敏度也比一般的检测方法高出100倍左右。还有一个明显的优点是实验中不需要PCR的后续处理及病原菌的分离培养，大大简化实验操作步骤，缩短检测时间。
3.3 qRT-PCR 技术在植原体导致的植物病害上的应用
廖晓兰等[50]根据植原体（phytoplasma）16 S rDNA保守区设计了3个植原体组间点突变特异性探针和1个TaqMan广谱探针，选取植原体和细菌以及植物样本进行实时荧光定量PCR，成功建立了植原体分类鉴定和检测的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法。
3.4 qRT-PCR 技术在病毒导致的植物病害上的应用
烟草环斑病毒（Tobacco ring spot virus，TRSV）为中国公布的二类禁止进境检疫有害生物，郑耘等[51]首次应用直接结合反转录实时荧光PCR技术检测烟草环斑病毒，由于首次把PCR管吸附病毒外壳蛋白、病毒核酸分子杂交与高灵敏度实时荧光PCR技术相结合，从而使病毒检测在准确性、特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上都比传统的PCR方法有所提高。与此同时杨伟东等[52]首次应用免疫捕捉反转录实时荧光PCR技术(IC-RT-Realtime PCR)成功检测烟草环斑病毒，由此解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、干扰物质存在而影响检测结果的问题，为植物病毒病原的快速、简便有效检测提供了一套科学的方法。
3.5 qRT-PCR 技术在线虫导致的植物病害上的应用
松材线虫病（Bursaphelenchus xylophilus）是世界四大林木病害之一，也是世界重要的检疫性有害生物。近年来，尽管地理环境、气候、不同寄主的影响，在形态上存在一定的差异[53]，但是实时荧光定量PCR技术的运用，使中国口岸检验检疫中多次截获相似穿孔线虫（Radopholus similis），目前根据TaqMan探针成功进行线虫检测的实例有松材线虫检测[54-56]和鳞球茎线虫（Ditylenchus dipsaci）检测[57]。
3.6 qRT-PCR技术在植物气孔变化相关激酶检测中的应用
气孔的作用是植物表皮调节外界环境与内部气体交换和吸收水分的一个重要器官。一些研究表明：在拟南芥中，气孔的开关主要与M PK3和M PK6两种激酶有关。通过利用实时荧光PCR技术，对与环境相关的M APKs激酶进行检测，M APKs激酶上游引物M KK4 和M KK5与M PK3和M PK6一起作用，调节气孔变化。
3.7 qRT-PCR技术在转基因植物检测中的应用
转基因植物检测贯穿于转基因植物研究和产业化的全过程，包括转化植株的鉴定、育种后代的筛选、外源基因插入表达分析、外源基因向相关物种漂移的检测等内容。转基因植物中表达的外源目的蛋白，主要分为抗虫、抗除草剂、抗病和延长果实成熟等功能。利用实时荧光PCR 技术，根据检测样品CT值的范围，可以准确快速地判断有无转基因成分。根据PCR技术的定量原理，可快速得到样品中转基因成分的准确含量。目前，我国已初步建立了TaqM an探针的荧光定量PCR法，在部分口岸进行转基因产品的检测。也利用TaqM an探针技术建立了商品化的转基因玉米Bt176、Bt11、M ON810、GA21等品系的检测方法。此外，实时荧光PCR技术在转基因农作物或初加工制品进行定量检测，如，在转基因水稻、转基因烟草的定量研究中发挥着越来越重要的作用。
4.内参基因
4.1内参基因的选择标准
理想的内参基因应满足以下条件:1.在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达[61];2.表达不受细胞周期调控,不受诸如温度、光照、生物或非生物胁迫等内源和外源信号的影响[62];3.其稳定的表达水平与目标基因表达水平相近[63]。但迄今为止,尚未发现这样的理想内参基因。
4.2传统内参基因的缺陷
在植物qRT-PCR研究中用的最多的内参基因通常是持家基因(housekeeping genes),主要包括18S rRNA, 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP-DH),转录延伸因子基因(EF-1A),多聚泛素酶基因(UBQ),肌动蛋白基因(ACT),A微管蛋白基因和B微管蛋白基因(TUA, TUB)等[60,61, 63, 64]。在前基因组时代,人们之所以选择持家基因作内参基因是因为持家基因是生物体维持生命活动所必需的细胞器骨架的基本组分(ACTTUA, TUB等)或参与生物体的基本生化代谢过程(GAPDH,EF-1A,UBQ等),因此持家基因应该在所有的细胞和生理状态下都较稳定地表达。但是,最近一些研究表明,持家基因在不同细胞类型和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的[58~62, 66]。这就使持家基因作为qRT-PCR内参基因的功能受到挑战。但是长期以来,人们在没有更好的内参基因供选择的情况下,仍采用传统的持家基因作内参基因而不去考虑在该实验条件下持家基因的表达是否会发生变化。这主要是由于以往的基因表达分析中,人们主要依赖于Norhtern杂交、组织化学染色或RT-PCR,而这种分析基本上是定性分析或相对定量分析,持家基因由于表达丰度高,如果目标基因表达被上调或下调就能明显表现出来。但是qRT-PCR是对基因表达的准确定量分析,传统的持家基因就不能满足定量分析对内参基因的要求。再者,持家基因在某些组织器官、发育时期或生理状态一般是稳定表达的,而当实验条件改变时它们的表达也会发生变化,而且不同类型的样品(如不同器官间的比较)持家基因的表达也不一样。如果考虑不到内参基因表达的变化就会导致qRT-PCR的结果准确性降低甚至得到相反或错误的结论[67~68]。例如18S rRNA基因常被用来作内参基因,但是并不是十分理想[65]。其一,18S rRNA表达丰度很高,当目标基因丰度较低时,定量结果准确性较低;其二, 18S rRNA要求反转录必须使用随机引物,而目标基因反转录常使用oligo dT,这可能会使二者的反转录效率不同而影响基因表达水平的可比性;其三,不同生理状态的组织器官中rRNA与mRNA的比例并不是恒定不变的,mRNA通常占总RNA的5% ~10%[70]。虽然rRNA合成的调节独立于mRNA, rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响,其表达水平也并不是恒定不变的,在有丝分裂期间, 18SrRNA明显减少或停止表达。再者, RNA的部分降解对18S rRNA的表达水平的影响似乎要小于对mRNA的影响[71]。Gutierrez等[72]分析了拟南芥10个传统内参基(ACT2,ACT7,ACT8,APT1,eF1A,eIF4A,TUB2, TUB6, TUB9, UBQ4, UBQ5, UBQ10,UBQ11)在14个不同组织器官中的表达稳定性,结果表明不同内参基因的稳定性存在显著差异,APT1和UBQ5的稳定性相对最好,而TUB6的稳定性最差。
Kim等[64]分析了4个水稻内参基因(18SrRNA,GAPDH, ACT,TUB)表达稳定性,结果表明18S rRNA无论是在不同发育时期的黄化苗,还是在不同品种和紫外伤害下的黄化苗,表达均最为稳定。Jain等[73]分析了10个常用内参基因(18SrRNA, 25S rRNA,UBC, UBQ5, UBQ10, ACT11,GAPDH, EF1A, eIF-4A和TUB)在25个水稻样品中的表达稳定性,结果表明UBQ5和EF1A在不同发育时期和组织器官中稳定性最好,而18SrRNA和25S rRNA在逆境胁迫样品中的稳定性最好。李钱峰等[74]以6个籼粳稻品种胚乳为研究材料,分析了7个常用持家基因(eEF-la, eIF-4a,UBC, GAPDH, UBQ-5, TBL和ACTl)表达稳定性,通过geNorm分析表明:不同的品种间,eEF-la和ACT1的表达最为稳定,UBC的表达变化最为明显。Hong等[75]分析了9个短柄草内参基因(ACT7, RCA, EF1A, GAPDH, SamDC,TUA6,UBC18,UBQ4,UBQ1)在21个不同发育时期组织器官在逆境胁迫(干旱、盐、冷、热)和激素条件下的表达稳定性,geNorm和NormFinder分析表明泛素结合酶基因18(UBC18)在所有供试样品中表达稳定性最好,UBQ4和UBQ10在不同组织器官和发育时期样品中表达最为稳定, S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SamDC)在环境胁迫样品中的表316期胡瑞波等:植物实时荧光定量PCR内参基因的选择表达最为稳定。Jian等[76]分析了10个大豆内参基因(ACT2/7,ACT11,TUA,TUB,ELF1A,UBC2,ELF1b,CYP2,G6PD,UBQ10)在21个不同发育时期、组织器官等样本中的表达稳定性,结果表明10个内参基因的表达稳定性存在显著差异,在所有供试样品中ELF1b和CYP2稳定性最好,G6PD和UBQ10的稳定性最差。在不同的组织器官或发育时期样品中,其稳定性也不同,ELF1b和CYP2适合于组织器官样品的表达分析,而ACT2/7和TUA在不同发育时期的样品中表达稳定性最好。Nicot等[68]分析了7个传统内参基因(ACT,APRT,18S rRNA, EF1A, TUB, CYP, Ribosomal protein L2)在马铃薯生物胁迫(晚疫病)和逆境胁迫(盐、干旱)条件下的表达稳定性,结果表明EF1A的稳定性最好。以不同稳定性的内参基因作标准,目标基因hsp20.2的表达水平变化很大,用稳定性差的内参基因作内参导致hsp20.2的表达水平有较大的误差。涂礼莉等[77]分析了7个内参基因(18SrRNA,Histone3,UBQ7,Actin2,CYP,UBQ1,UBQ2)在棉花不同组织和不同发育时期的表达稳定性,发现在纤维发育的后期这些基因的表达都下调,而纤维发育后期特异表达基因AGP的表达则上调。Histone3,UBQ和UBQ1在棉花纤维发育过程中稳定性较好,而ACT2和UBQ2稳定性最差。Iskandar等[78]分析了4个内参基因(ACT,TUB,GAPDH,25S rRNA)在甘蔗不同组织器官和不同品种中的表达稳定性,结果表明25S rRNA在不同样品间的表达水平最为一致,GAPDH在不同组织器官中稳定性最好。Brunner等[65]分析10个传统基因(UBQ11,TUA,18SrRNA,ACT2,UBQ7,EF1b,TUB, ACT11,EIF4b,CYP)在杨树8个不同发育时期样品中的表达稳定性,发现不同的内参基因的稳定性存显著差异, 18S rRNA表达丰度最高,TUA表达丰度最低,UBQ11和TUA在不同样品间变异系数最小,表达最为稳定,而CYP稳定性最差。
综上,已有研究结果表明,不同植物和不同样品间的qRT-PCR内参基因的稳定性存在显著差异。因而,针对特定的实验条件和样品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因表达结果至关重要。
5.关键酶基因
茅苍术的主要成分为挥发油，倍半萜类化合物是其中主要的活性成分，这类成分通过甲羟戊酸（mevalonic acid , MVA）代谢途径中一系列的酶来合成，其中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A , HMGR）是MVA 途径中的第一个限速酶，法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophosphate synthase , FPPS）则是其下游分支点生物合成的关键酶（Kim等2016；Kalita等2015；Zhao等2015和Zhang等2015）。在品质形成及胁迫对其造成影响的研究中，qRT-PCR分析相关基因表达研究尤为重要，而茅苍术内参基因筛选及基因表达分析相关研究鲜见报道。
5.1 HMGR生物学意义
在哺乳动物中，人们通过研究HMGR在胆固醇合成中所起到的作用，认为HMGR所催化的反应在甾醇合成过程中是一个限速反应; Laurence等通过研究HMGR突变烟草的甾醇含量发现HMGR同样在植物萜类合成途径中起关键调节作用。HMGR是植物的MVA途径中第1个关键酶，连同NADPH催化3-羟基-3-甲基戊二酰CoA生成甲羟戊酸，这个反应在是一个不可逆的过程，也是萜类合成过程中的重要调控点。在药用植物中，HMGR通常由多条基因共同参与编码，基因家族成员的差异性表达使其具有决定碳流流向的功能，且该功能可借助转基因技术将HMGR导入目标植物，提高活性成分的含量。例如在荔枝中，这种基因的差异性表达通过影响细胞的早期分裂而影响了最终果实的大小。而在丹参中，HMGR基因家族中的各条基因在不同部位有不同水平的表达。
5.2 植物中HMGR克隆情况
HMGR首次由Caelles C等于1989年在拟南芥中克隆得到，1994年，Enjuto M等研究发现，拟南芥中存在2条不同基因均能编码HMGR，证明了HMGR基因家族中存在多条基因.截止2012年9月，植物HMGR的全长mRNA已分别从玉米、水稻、苍术等超过48种植物中克隆出来。
5.3部分药用植物中HMGR的研究
红豆杉的HMGR全长基因记录有1条(TmHMGR:AY277740) 由Liao Z等2004年注册，基因长度为2113bp.PI为7.04，理论蛋白质分子质量为63.6kDa这是首次从裸子植物中克隆得到HMGR，有助于丰富HMGR进化树.TmHMGR基因开放阅读框长度为1791bp，编码596个氨基酸.生物进化学分析TmHMGR基因比其他植物中的HMGR基因更为原始，该实验中得到的TmHMGR应 属 于 一 个 小的基因家族.但 在TmHMGR中同样存在2个跨膜区和一个催化区的植物TmHMGR标志性结构.对不同组织内TmHMGR表达情况分析发现，该基因在根，茎，针叶中均有表达，而在茎，针叶中要强于根。Liao Z等对TmHMGR基因进行功能鉴定证明其具有调控紫杉醇类物质合成的功能，且能影响针叶和茎的生长发育。
人参中的主要有效成分是人参皂苷，是四环三萜达玛烷型化合物。目前为止Genbank注册的人参的HMGR全长序列只有1条 (序列号为GU505697)，由Kim等在2011年注册，该基因的全长为1993bp,而郜玉钢等［57］曾2010年得到了1条人参HMGR的核心片段，该片段的大小为485bp。与其他植物的HMGR基因序列有较高的同源性，证明了该基因序列具有较高的保守性.
5.4 植物FPPS的组织表达
国内外学者对法呢基焦磷酸合酶基因在植物中的表达模式进行了研究，发现该基因具有组织表达特异性，而且也伴随着类异戊二烯衍生物含量的增加。Cunillem等(1996)克隆了拟南芥FPS2 cDNA，分析表明拟南芥FPPSl和劂基因在幼苗、根、茎、叶和花中都表达，其中，FPPSl mRNA在根和花序中最高表达，而FPPS2 mRNA则以较低水平表达，但优先在花序中累积。Li和Larkins(1996)发现在玉米胚乳发育早期(授粉后10--14 d)rP粥处于最高表达水平，而在苗和胚中的表达则非常微弱。
Cervantes等(2006)对授粉后0、5、10、15和20 d的玉米胚乳中FPPS表达进行了检测，发现只有在15和20 d的胚乳中才能检测到基因表达，而编码淀粉合成酶的基因Shrunken．J也具有相似的表达模式，也是在15和20 d的胚乳中进行基因表达，说明FPPS基因与产量性状有关联。刘长军等(1998)发现在棉花种子发育早期，开花后20~27 d的FPPSl基因保持相对稳定的表达水平，但从开花后27 d到种子成熟，FPPSl mRNA的转录水平迅速增高，此期倍半萜棉毒素在种子中的积累亦呈明显的增长趋势。Gaffe等(2000)利用番茄全长 cDNA作探针研究番茄全部FPPS转录子的积累，发现在所有组织中均表达，最高表达水平出现在幼果中，但在叶、花和幼苗子叶中也具有较强的信号，而在幼苗根、胚轴和成熟绿果中信号较弱；利用LeFPSl cDNA 3端的非翻译区作探针，研究LeFPSJ基因表达，发现在叶、花和果中可观察到类似的mRNA累积模式，但在幼苗子叶中观察不到任何信号。FPPS转录水平在植株顶端的幼叶和未开的花中较高，而在叶片发育中和已经开放的花中则显著降低。FPPS mRNA在植株较低部分的叶片中仍能检测到。FPPS mRNA在幼果中很丰富，但随着果实成熟逐渐降低。在果实成熟过程中，FPPSmRNA量又开始增加，但与幼果相比，增加的程度较小。研究表明，LeFPSl基因在所有果实发育阶段都表达，表明FPPS基因的表达大多与细胞分裂和伸长有关。Wang等(2004)发现银杏GbFPS基因在根和叶中高表达，而在茎中则低表达，表明银杏内酯的生物合成发生于根和叶中。Liao等(2006)发现曼地亚红豆杉TmFPSl基因在针叶、茎和根中都有表达，但在表达水平上没有显著差异。Yin等(2011)对乐昌含笑McFPS基因器官表达模式分析表明，该基因只在叶片中强烈表达，而在根和茎中无任何表达，暗示McFPS是一个叶片器官特异表达基因，这与叶片香精油主要由倍半萜组成的分析结果相一致。Gupta等(2011)发现睡茄WsFPPS基因在所有组织中普遍表达，但在幼叶和花中表达水平最高，在茎干中表达水平最低。
基因过表达研究表明，FPPS基因能够提高转化植株中类异戊二烯物质的含量。Daudonnet等(1997)将酵母fps基因转入烟草，发现转基冈植株中甾醇和类胡萝卜素含量显著增加。Chen等(2000)将棉花FPPS基因的cDNA转入青蒿中，发现在5个转基因株系中得到表达，青蒿素含量比对照高出约2～3倍，为8～10 mg／g DW。Han等(2006)将青蒿法呢基焦磷酸合酶基因FPSl在青蒿中过量表达，发现转基因青蒿FPPS活性比非转基因青蒿活性高2～3倍，在转基因青蒿中最高青蒿素含量约为干重的0．9％，比非转基因青蒿高34．4％。崔红等(2006；2007)将薄荷法呢基焦磷酸合酶基因fps转入烟草，使转基因烟草植株对赤星病抗性明显提高。Kim等(2010)将人参PgFPS基因转入积雪草，导致下游达玛烯二醇合酶基因(CaDDS)和环阿屯醇合酶基区(CaEYS)在所有发根系中较高表达，暗示FPS导致三萜生物合成活性的改变，另外鲨烯等植物甾醇含量也大幅度提高。
6.展望
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR , qRT-PCR）是基因表达分析研究的重要技术手段，为确保定量分析结果的准确性和可靠性，需选择一个稳定表达的基因作为内参基因，越来越多的研究表明，看家基因在同植物不同细胞类型或不同处理条件下的表达不是绝对稳定的。因此，根据不同情况选择可靠、稳定表达的内参基因在基因差异表达分析中显得至关重要。
茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.) DC.，为菊科多年生草本植物，临床应用广泛。近年来由于过度采挖、生境破坏及其自身生物学特性，道地茅苍术已成为濒危物种，而干旱等胁迫已成为影响其品质形成的重要限制因子。茅苍术的主要成分为挥发油，倍半萜类化合物是其中主要的活性成分，这类成分通过MVA代谢途径中一系列的酶来合成，其中HMGR是 MVA途径中的第一个限速酶，FPPS则是其下游分支点生物合成的关键酶。在品质形成及胁迫对其造成影响的研究中，qRT-PCR分析相关基因表达研究尤为重要，而茅苍术内参基因筛选及基因表达分析相关研究鲜见报道。
因此筛选出用于分析正常和干旱胁迫条件下茅苍术不同组织中稳定表达的理想内参基因，并研究茅苍术开花初期倍半萜类活性成分生物合成关键酶HMGR、FPPS基因的差异表达尤为重要。研究结果可以为茅苍术活性成分生物合成机制研究提供参考，也为进一步进行干旱等逆境条件下茅苍术品质评价研究提供奠定基础。
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3. 设计方案和技术路线
一．研究方案
1.材料采集
于江苏句容茅山采集菊科植物茅苍术A. lancea(Thunb.) DC.。
4. 工作计划
时 间 | 研究内容 |
2022年1月-2月 | 查阅文献和著作，整理研究现状。 |
2022年3月上旬 | 确立与优化实验方案。 |
2022年3月下旬 | 初步试验、实验条件选择。 |
2022年4月 | 进行实验研究。 |
2022年5月 | 整理和分析实验数据，撰写毕业论文，准备答辩。 |
5. 难点与创新点
1.研究首次对正常及干旱胁迫条件下茅苍术内参基因进行筛选，并对其在正常条件下茅苍术开花初期萜类有效成分合成关键酶HMGR 、FPPS 基因的在不同组织中的表达情况进行分析研究。
2.研究为茅苍术内参基因的筛选奠定了基础，为研究正常条件下茅苍术基因差异表达分析提供参照，也进一步为研究干旱等其他逆境条件下茅苍术基因差异表达分析提供较好的参考。
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