1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
活血丹G1echomalongituba(Nakai)Kupr.为唇形科活血丹属多年草本植物，又名遍地香、地钱儿、金钱薄荷、透骨消、透骨风等。其干燥地上部分入药，药材名连钱草（《中华人民共和国药典》（2015年版）收录）。春至秋季采收，除去杂质，晒干入药。味辛、微苦，性微寒，入肝、肾、膀胱经。有清热解毒、利尿通淋、散瘀消肿的功能[1]。我国连钱草资源丰富，是各地民间广泛应用的药用植物，其临床主要应用于跌打损伤、风湿骨痛、腮腺炎、黄疸型肝炎、胆囊炎、胆石症、肾结石、膀胱结石、多发性脓疡、疮痈肿痛、婴儿湿疹、疟疾、产后惊风、腹痛、牙痛等症的治疗[2]。生于林缘、疏林下、草地中、溪边等阴湿处，海拔50～2000m。花期4～5月，果期5～6月。主产于江苏、浙江一带。
有关活血丹的化学成分的研究，根据文献的报道可知，主要成分为黄酮及其苷类，挥发油，有机酸，萜类，生物碱，醇和其他类等[3-6]。活血丹中除了黄酮和有机酸外，含有丰富的三萜酸类成分，其中齐墩果酸和熊果酸是活血丹中主要所含的五环三萜类，具有抗肿瘤、抗炎、保肝、消炎、降糖等作用[7-9]。对于连钱草药材的质量控制,《中华人民共和国药典》(2015年版一部)主要通过性状、显微特征和木犀草素的薄层色谱来鉴别药材的真伪,通过检查杂质、水分、总灰分和酸不溶性灰分以及测定醇溶性浸出物的含量来控制药材的质量。近年来，有学者相继报道连钱草中三萜酸类成分(主要为熊果酸和齐墩果酸)和总黄酮的含量测定方法,并以此来控制该药材的质量[10-12]。要保证活血丹三萜酸类含量测定方法的准确性、稳定性以及提高重现性，首先就要选择一个最优的提取工艺。吴茗希等[13]选用正交试验法优选出微波萃取法提取连钱草中总三萜酸的最佳工艺条件，并与传统的醇提取法相比较，发现微波萃取法在提取时间、溶剂用量和得率等方面明显优于传统的醇回流法。
响应面法(ResponseSurfaceMethodology，RSM)是试验设计、数理统计和最优化技术的一种综合应用，是数学方法与统计方法结合的产物，是用来对所感兴趣的响应受多个变量影响的问题进行建模和分析的，其最终目的是优化该响应值。近年来，响应面法在试验设计、优化方面的应用越来越多，在药学研究领域也非常受欢迎[14-18]。响应面法是利用统计学的综合试验技术解决复杂系统输入(试验变量)与输出(响应或试验指标)之间关系的一种方法[19]。响应面法的特点和优势是通过设计合理的有限次数试验，建立一个包括各显著因素的一次项、平方项和任何两个因素之间的一级交互作用项的数学模型，从而拟合出因素与响应间的全局函数关系，有助于快速建模，缩短优化时间和提高应用可信度。然后通过对函数响应面和等高线的分析，对影响响应值的各因素水平及其交互作用进行优化和评价，快速有效地确定多因素系统的最佳条件[20]。响应面分析法由于试验次数少，试验精度高，并适合于多因素、多水平的试验，比正交设计试验法更简化，比均匀设计更全面，且得到的关系式可以确定在试验范围内的任何试验点的预测值，因而显示出突出的优势。
本论文将以活血丹为材料，采用响应面法优化超声辅助醇提活血丹三萜酸类成分，在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度、料液比、超声温度、超声时间为自变量，活血丹三萜酸类的提取率为响应值，依据Box－Benhnken原理设计四因素三水平实验，探索其最佳提取工艺条件。以期提高高效液相色谱法（HPLC法）测定活血丹三萜酸类成分含量的稳定性和重现性，为该药材的质量控制提供科学依据。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
以活血丹为材料，采用响应面法优化超声辅助醇提活血丹三萜酸类成分，探索其最佳提取工艺条件。以期提高高效液相色谱法（HPLC法）测定活血丹三萜酸类成分含量的稳定性和重现性，为该药材的质量控制提供科学依据。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法
超声提取、响应面优化分析
技术路线
实验方案
1材料处理流程
新鲜活血丹→清水洗净→晒干→粉碎→过60目筛→干燥→塑封保存→实验材料
2提取工艺
称取少量活血丹干燥粉末于锥形瓶中，加入一定体积的适宜浓度的乙醇溶液，称定重量后超声使充分提取，取出静置使冷却至室温，称定补足重量，抽滤，取续滤液，即得活血丹提取液，备用。
3活血丹三萜酸类含量的测定（液相检测法）
色谱柱：迪马钻石plusC18，4.6250mm，5μm；流动相乙腈（A）:0.5%醋酸铵（B）为77:23进行等度洗脱，检测波长为210nm；流速为0.5mL/min；进样量为20μL。
4单因素实验
4.1乙醇浓度选取40%~80%梯度浓度，固定料液比为1∶20，于50℃条件下反应50min，分析乙醇浓度对提取率的影响。
4.2料液比选取1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL，固定乙醇浓度60%，于50℃条件下反应50min，分析料液比对提取率的影响。
4.3超声温度选取40、50、60、70、80℃，固定乙醇浓度60%，料液比1∶20，于不同温度下反应50min，分析超声温度对提取率的影响。
4.4超声时间选取15、30、45、60、75min，固定乙醇浓度60%，料液比1∶20，于60℃下反应不同时间，分析超声时间对提取率的影响。
根据上述设计做单因素实验，取三次重复的平均值，初步确定每个因素的最佳范围，探究各因素活血丹三萜酸类提取率的影响。
5活血丹中三萜酸类物质提取工艺的响应面优化
响应面设计在单因素实验的基础上，综合各因素的影响，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声时间(C)、超声温度(D)作为实验因素并确定各因素合适的水平数，以活血丹中三萜酸类的提取率(R1)为响应值，运用Design-Expert8.0.6软件进行Box-Behnken响应面设计和数据分析。实验因素分别以A、B、C、D表示，每个因素的高中低水平分别以1、0、-1进行编码，进行设计四因素三水平实验设计。
6数据处理
采用Design-Expert8.0.6软件对实验数据进行分析处理并对各因素间的交互作用做回归分析。
可行性分析：
1)响应面分析法试验次数少，试验精度高，并适合于多因素、多水平的试验，相比正交设计试验法更简化，比均匀设计更全面。
2)查阅了大量文献，具备一定的知识基础。
3)所在的院系具有实验所需要的仪器设备，可以满足本项目研究对仪器的要求。
4. 研究创新点
近年来,越来越多的学者通过对连钱草中三萜酸类成分(主要为熊果酸和齐墩果酸)和总黄酮的含量进行测定,来达到控制该药材质量的目的。那么要保证活血丹三萜酸类含量测定方法的准确性、稳定性以及提高重现性，就要选择一个最优的提取工艺，但目前超声提取活血丹内三萜酸类的工艺仍未找到一个最佳提取条件。
本论文将以活血丹为材料，采用响应面法优化超声辅助醇提活血丹三萜酸类成分，探索其最佳提取工艺条件。以期提高高效液相色谱法（HPLC法）测定活血丹三萜酸类成分含量的稳定性和重现性，为该药材的质量控制提供科学依据。
5. 研究计划与进展
2015.102015.11确定研究课题，查阅相关文献，了解最新动态，细化研究内容，确定研究方法，并制定实施方案。
2015.112016.01到野外采集新鲜活血丹地上部分，做实验前处理，并做好保存工作。
2016.012016.02进行预实验，根据预实验结果对实验方案进行调整。
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