不同水分处理的垂盆草对CCl4诱导HepG2细胞损伤的保护作用研究开题报告

 2023-02-16 09:07:09

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

选题的意义：

垂盆草( Sedum sarmentosum Bunge)为景天科( Crassulaceae) 多年生草本植物，分布广泛。中药垂盆草为景天科植物垂盆草的干燥全草，具有清热解毒、利湿退黄的功效，多可用于治疗湿热黄疸，小便不利，痈肿疮疡等疾病[1]。药理研究显示，垂盆草提取物具有保肝护肝[2]、免疫抑制[3]、雌激素作用[4]、增强肌力[5]、抗肿瘤[6]等功效，但目前对于栽培措施如何影响垂盆草药理活性的研究鲜见报道。因此，本课题通过研究不同水分处理的垂盆草对CCl4诱导HepG2细胞损伤的保护作用，从而得到当垂盆草提取液具有较大保肝作用时，垂盆草的最佳水分处理条件，为垂盆草定向品质调控提供理论依据。

国内外研究概况：

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2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

以不同水分处理60 d的垂盆草为研究对象[5个水分梯度分别是：土壤含水量分别为田间持水量的15%~20%（S1）、35%~40%（S2）、55%~60%（S3）、75%~80%（S4）、95%~100%（S5）]，构建CCl4诱导HepG2细胞损伤模型，观察不同水分处理的垂盆草水提液的保护作用，并测定细胞存活率及谷丙转氨酶、谷草转氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶的活性大小。通过比较不同处理垂盆草提取液对肝细胞的保护作用大小，进而筛选出垂盆草的最佳水分处理条件，以期为垂盆草定向品质调控提供理论依据。

研究内容：

1.测定不同水分处理的垂盆草水提液对CCl4诱导HepG2细胞后存活率的影响。

2.测定不同水分处理的垂盆草水提液对CCl4诱导HepG2细胞后，细胞谷丙转氨酶的活性。

3. 测定不同水分处理的垂盆草水提液对CCl4诱导HepG2细胞后，细胞谷草转氨酶的活性。

4. 测定不同水分处理的垂盆草水提液对CCl4诱导HepG2细胞后，细胞超氧化物歧化酶的活性。

5. 测定不同水分处理的垂盆草水提液对CCl4诱导HepG2细胞后，细胞丙二醛的含量。

6. 测定不同水分处理的垂盆草水提液对CCl4诱导HepG2细胞后存活率的影响保护作用下，细胞谷胱甘肽的含量或细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活性。

拟解决的关键问题：

1.各水分梯度的选取以及保持；

2.进行构建CCl4诱导HepG2细胞损伤模型的预实验；

3.如何进行细胞存活率及各种指标的测定，等等。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1.文献分析法；

2.实验法；

3.因素分析法。

技术路线：

实验方案：

1.细胞培养

培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时，把原有培养基吸掉；加适当的胰蛋白酶(0.25%)，消化1-2分钟；细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化；用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15mL的离心管中，1000转离心5分钟；倒掉上清液，加1-2mL培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养。

2.分组处理

实验时分为空白组（HepG2细胞），模型组（HepG2细胞 CCl4），5个实验组（HepG2细胞 5个水分梯度处理垂盆草水提液 CCl4）和水飞蓟宾组（即对照组，HepG2细胞 水飞蓟宾 CCl4），每组给予药物孵育72 h后，加入40 mmolL-1 CCl4损伤1.5 h，之后进行细胞评价。

3.MTT法检测细胞存活率

细胞消化、计数、配制成浓度为5104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每加入100μL细胞悬液；将96孔细胞培养板置于37℃，5%CO2培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组；将96孔细胞培养板置于37℃，5% CO2培养箱中培养72小时；将96孔板进行MTT染色，λ=490nm，测定OD值，计算细胞存活率；

细胞存活率=A实验组/A空白组100%

4.ALT、AST、SOD、MDA、GSH及GSH-Px活性检测

将处于对数生长期的细胞消化接种到细胞板中，根据分组设置分别加入对应的含药培养基，药物作用72 h后，收集细胞，吸取上清，按照试剂盒说明分别测定ALT、AST、SOD、GSH-Px活性及MDA、GSH含量。

可行性分析：

（1）本项目研究目的明确，实验设计合理且条理清晰，具有很强的针对性。

（2）本项目所涉及的实验方法成熟，属于经典生化实验，具有很强的可操作性，且实验所涉及的仪器操作较为简便，经指导老师提供，已基本具备。

（3）中药实验中心的实验室设施完备，分光光度计、高速台式冷冻离心机等必备的仪器设施齐全；各类基本药品、试剂均可直接从实验室获取。

（4） 关于垂盆草的保肝护肝作用，国内外学者目前已经有一定的研究基础。在前者的研究基础上，本项目通过探究不同处理垂盆草提取液对肝细胞的保护作用大小，进而可以达到本项目的预期结果。

综上所述，本实验可行。

4. 研究创新点

特色创新之处：

目标创新，通过测定垂盆草药理作用的相关指标变化水平，分析不同水分处理的垂盆草对CCl4诱导HepG2细胞损伤的保护作用。进而分析垂盆草提取液具有较大保肝作用时的最佳水分处理。这一栽培措施研究角度目前没有太多实践证明，想法较为新颖。目前，对于栽培措施如何影响垂盆草药理活性的研究鲜见报道。而本课题通过研究垂盆草的最佳水分处理， 能为垂盆草定向品质调控提供理论依据，同时也是对垂盆草的药理研究提供新思路。

5. 研究计划与进展

2017.3-2017.4 查阅文献，准备资料，提出实验的具体方案

2017.4 进行预实验，发现实验方案之中的不足，优化实验方案为后来的工作打下基础。准备实验试剂。

2017.6-2017.12 进行实验，开始逐步进行各个酶的测定，得到数据。

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