1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 草坪草耐镉研究的重要意义1.1重金属隔的危害众所周知镉是重金属五毒元素之一，它具有分解周期长（半衰期超过20a）、毒性高、移动性大、难降解等特点，在生产活动中容易被作物吸收富集，因此严重影响了作物的品质和产量，还通过食物链在人体积累而危害人体健康。
近年来，随着我国工农业的发展，农业上化肥、农药的大量施用，工业废水和污泥的利用；不仅如此，重金属大气沉降的日益增加，土壤中镉的含量明显增加，土壤镉污染状况越发严重。
目前，我国镉污染土地的面积已达210km，占我国总耕地面积的1/6。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标在本课题组前期工作基础上，结合前人研究中未解决的科学问题，本项目拟完成研究目标：采用酵母双杂交系统从海滨雀稗文库中挖掘与PvSnRK2.4互作的蛋白，并进一步验证其真实性。
2 研究内容 研究工作内容以海滨雀稗SnRK2家族I类成员SnRK2.4为研究对象，展开其互作蛋白的筛选及验证工作：（1）以前期构建的海滨雀稗植株酵母双杂文库pDEST22质粒为筛选对象，以pDEST32-SnRK2.4位诱饵蛋白质粒，采用PEG/LiAc法共转MAV203酵母感受态细胞，共转化筛选单克隆。
将单克隆扩大培养后重复点板验证，经确定的菌液提取质粒，转化大肠杆菌后PCR扩增并测序，获得SnRK2.4互作候选蛋白。
3. 研究的方法与方案
1 实验方案海滨雀稗 SnRK2 家族I类成员互作蛋白的筛选与验证① 海滨雀稗cDNA三框酵母双杂交表达文库制备（已完成）：以海滨雀稗Seaspray镉胁迫后不同时间段（0、3、24h）的叶片和根为材料，液氮速冻，等量混合提取RNA，用于酵母双杂交文库构建。
采用步骤如下：采用Plant RNA Kit（OMIGA）提取海滨雀稗总 RNA，FastTrack MAG mRNA Isolation 试剂盒进行 mRNA 纯化；cDNA 双链合成；将 cDNA 双链分三等份分别加三个重组接头（为防止移码）后混合并进行分离纯化；纯化的 cDNA 双链与 pDONR/Zeocin 载体进行 BP 重组反应、转化 DH10B 电转感受态细胞获得入门文库混合质粒；将入门文库混合质粒与酵母双杂交载体pDEST22（TRP1，AmpR）通过LR重组反应、转化DH10B电转感受态细胞获得酵母双杂交次级文库混合质粒。
② 互作靶蛋白X的筛选：将已获得的PvSnRK2.4基因经PCR扩增、酶切、LR 重组构建到诱饵质粒pDEST32（LEU2，KanR）上，与①构建好的文库质粒采用 PEG/LiAc 法共转化酵母感受态细胞MAV203，混合培养后涂到 SD/-Leu/-Trp/-His 25 mM 3-AT 平板上 30℃培养，3-5天后从平板上筛到的克隆再在平板上划线培养进一步验证。
4. 研究创新点
（1）选题针对性强：重金属镉胁迫是影响草坪草在镉污染地区园林绿化和生态治理中的重要限制因子，关于草坪草的耐镉评价及生理机制的研究已有报道，但草坪草耐镉分子机制尚不清晰。
本申请项目拟在前期工作基础上，围绕海滨雀稗中负调控耐镉的SnRK2家族I类成员PvSnRK2.4，展开其耐镉分子调控机制的研究，具有明显的创新性。
（2）研究内容新颖：前期对SnRK2家族I类成员基因的研究仅局限在耐镉表型及生理机制上，其具体的分子互作调控机制尚不清楚。
5. 研究计划与进展
2017年11月2018年1月海滨雀稗cDNA三框酵母双杂交表达文库制备，获得文库质粒；PvSnRK2.4诱饵质粒的构建2018年 2月2018年 4月酵母双杂交筛选与互作蛋白基因获得2018年 5月2018年 6月靶蛋白X与PvSnRK2.4的互作真实性验证；毕业论文定稿，进行毕业答辩。
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