水稻细菌性条斑病三型效应因子Xop AF及Xop AK蛋白的亚细胞定位和致病功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

中国水稻播种面占全国粮食作物的1/4，而产量则占一半以上。栽培历史已有14000～18000年。为重要粮食作物；水稻细菌性条斑病是水稻上最重要的病害之一,在中国南方大部分水稻种植区都有发生,由于缺少有效抗病基因，近年危害逐渐加重。提高水稻抗病性已成为保障我国水稻生产安全的重要途径。双子叶模式植物拟南芥的抗病机制已得到深入研究,但对单子叶模式植物水稻抗病途径的了解仍旧十分匮乏[1]。在抗性基因与抗病品种的筛选以及抗性品种的培育方面,进行了水稻抗细菌性条斑病的遗传育种研究[2] 。以高抗细条病水稻品系Dular和H359R为抗性供体亲本,在筛选与抗病基因紧密连锁的SSR分子标记的基础上,通过混合选择结合MAS技术的方法,将QTL聚合在一起。连锁SSR标记的筛选结果表明,紧密连锁的SSR标记与相应的目标QTL的推测距离在0.4～4.9cM,可以满足MAS对标记选择准确率的要求。MAS选择结果表明,有效聚合2～4个目标QTL是培育广谱抗细条病品种的有效途径[3]。水稻细菌性条斑病又称细条病、条斑病，主要为害叶片。病斑初为暗绿色水浸状小斑，很快在叶脉间扩展为暗绿至黄褐色的细条斑，大小约1×10mm，病斑两端呈浸润型绿色。病斑上常溢出大量串珠状黄色菌脓，干后呈胶状小粒。发病严重时条斑融合成不规则黄褐至枯白大斑，与白叶枯类似，但对光看可见许多半透明条斑。病情严重时叶片卷曲，田间呈现一片黄白色。病原为：Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Fang，Ren，Chu，Faan，Wu）Swings称稻生黄单胞菌条斑致病变种，属黄单胞杆菌属细菌。水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）包括两个致病变种,分别是水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae、简称Xoo）和水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola,简称Xoc）,二者分别在水稻（Oryza sativa）上引起白叶枯病和细菌性条斑病。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的Ⅲ型分泌系统(type-Ⅲsecretion system,T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors,T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response,HR)以及在感病寄主植物上具有致病性[4]。根据水稻黄单胞菌T3效应因子序列的特征，分成两大类：Xanthmonas outer protein （Xop）效应蛋白和转录激活因子(transcription activator-like,TAL)。为区别TAL效应因子，Xop蛋白也常被统称为non-TAL效应子。水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)hrcQ基因在动植物病原细菌中高度保守。不同植物病原细菌的HrcQ蛋白因在N端有变化,推测可能与分泌的效应分子特异性有关。但水稻条斑病菌HrcQ蛋白对Ⅲ型分泌系统(typeⅢsecretion system,T3SS)的形成以及对效应分子的分泌性影响还不清楚。为弄清HrcQ蛋白在此方面的作用,利用同源重组方式获得了水稻条斑病菌hrcQ基因的敲除突变体,该突变体丧失了在烟草上激发过敏性反应的能力和在水稻上的致病性。hrcQ基因与水稻细胞互作时受诱导表达。蛋白质-蛋白质互作结果显示,HrcQ可分别与Hpa1、HrcN、HrpB5和HrpB2互作。分泌性检测发现,HrcQ不通过T3SS分泌至胞外。hrcQ基因突变,影响Hpa1和HrpB2蛋白分泌。这些结果表明,HrcQ蛋白是形成Ⅲ型分泌系统的基本组分,并通过帮助Hpa1和HrpB2等T3SS效应因子的分泌,从而影响病菌在非寄主上的过敏性反应和在水稻上的致病性。这为进一步分析水稻黄单胞菌T3SS的形成和分泌机制奠定了基础[5]。T3SS是Xoo和Xoc的关键毒性因子,在两个致病变种中高度同源和保守,可以用作新型药物分子设计的靶标[6]。其病菌分泌到植物细胞内的转录激活子样(transcription activator-like,TAL)和非转录激活子样(non-TAL)效应蛋白对病原菌的致病性至关重要,但目前对单个non-TAL效应蛋白发挥毒性功能的分子机制了解十分匮乏[7]。在大规模的基因组测序以及转录组测序的基础上，水稻黄单胞菌中部分TAL效应因子的功能得到了鉴定，而对non-TAL效应因子近几年来也得到比较广泛的研究,经研究发现基因组中各个效应子的表达水平高低不同，再加上功能的冗余现象，许多效应子的生物学功能比较难于揭示。从目前的研究结果看，non-TAL效应因子的主要功能与调控寄主的防卫反应有关，有些具有显著的酶活性，如泛素连接酶等，另外猜测一些效应因子参与了干扰寄主的细胞器的功能，进而颠覆寄主的防卫反应[8]。

此次探讨Xoc菌株中Xop AF及Xop AK基因在水稻中的亚细胞定位。两个基因在基因组的注释中具有两个版本。我们前期gfp融合包含两CDS区域及推测的5’ UTR区在水稻黄单胞菌中的表达发现在黄蛋白菌中的表达是倾向于大的编码区。本课题将利用两基因的可能的不同表达产物融合荧光蛋白进行水稻原生质体瞬时表达，观察荧光，从而研究两蛋白不同产物在水稻中的亚细胞定位。结果有助于理解该2种蛋白的表达产物在致病机制中与调控寄主亚细胞器功能的关系。

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